Generatie van Murine Primaire Colon Epitheliale Monolayers uit Intestinal Crypts

Alle hieronder beschreven procedures zijn goedgekeurd en uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen van het University of Michigan Institutional Animal Care and Use Committee. 1. Voorbereiding van reagentia voor crypte-isolatie en -kweek (voorbereiden in weefselkweekkap) 50 mM ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA): Voeg 50 ml 0,5 m bouillon toe aan 450 ml fosfaatgebufferde zoutoplossing, zonder calcium (Ca2+) en magnesium (Mg2+) om 500 ml te bereiden. In dit protocol verwijst PBS naar PBS zonder calcium en magnesium, tenzij anders vermeld. Schudbuffer: Los 7,4 g sacharose (43,3 mM) en 5 g sorbitol (54,9 mM) op in PBS om 500 ml te bereiden. L-WRN (L-Wnt-3A, R-spondin en Noggin) media: Supplement Advanced Dulbecco’s Modified Eagle Medium/Ham’s F-12 (DMEM/F12) (780 mL) met 20% Foetale Runderserum (FBS) (200 ml), 1x in de handel verkrijgbaar glutaminesupplement (10 ml), 100 U/ml penicilline Haal L-WRN-cellen door ATCC, kweek in T175-kolven en selecteer met Geneticine en Hygromycine. Media worden gedurende 12 dagen gewijzigd en verzameld.OPMERKING: Elke batch media wordt getest op Wnt-activiteit met behulp van een TOPflash Wnt Reporter-test. In dit geval werden de Michigan Medicine Translational Tissue Modeling Laboratory protocollen (https://www.umichttml.org/protocols) gevolgd. De TOPflash HEK 293 cellijn wordt gekweekt tot samenvloeiing in een T75 kolf, trypsinized en geplateerd op een 96-well plaat. De volgende dag worden verschillende verdunningen van de verzamelde media toegevoegd aan cellen en geïncubeerd in een couveuse van 5% CO2 bij 37 °C ‘s nachts. De volgende dag worden de cellen gelyseerd en wordt de Firefly Luciferase-test uitgevoerd volgens de instructies van de fabrikant. De test wordt genormaliseerd met behulp van recombinant Wnt-3A. De media zijn verdeeld in 25 ml aliquots in 50 ml conische buizen en bewaren bij -80 °C. Basismedia: Voor 500 ml, supplement Advanced DMEM/F12 (448 mL) met 2x in de handel verkrijgbaar glutaminesupplement (10 ml), 20 mM HEPES (10 ml), 100 U/ml penicilline en 100 g/ml streptomycine (10 ml), 2 ml N-acetyl-L-cysteïne (2 ml), N2-supplement (10 ml) en 10 ml streptomycine (10 ml), 2 ml N-acetyl-L-cysteïne (2 ml), N2-supplement (10 ml) en 10 ml streptomycine (10 ml), 2 ml N-acetyl-L-cysteïne (2 ml), N2-supplement (10 ml) en 100 ml streptomycine (10 ml), 2 mM N-acetyl-L-cysteïne (2 ml), N2-supplement (10 ml) en 10 ml streptomycine (10 ml), 2 ml N-acetyl-L-cysteïne (2 ml), N2-supplement (10 ml) en 10 ml streptomycine (10 ml), 2 mM N-acetyl-L-cysteïne (2 ml), N2-supplement (10 ml) en 100 ml streptomycine (10 ml), 2 mM N-acetyl-L-cysteïne (2 ml), N2-supplement (10 ml) en 10 ml streptomycine (10 ml), 2 mM N-acetyl-L-cysteïne (2 ml), N2-supplement (10 ml) en 10 ml Verdeel de media in 25 ml aliquots in 50 ml conische buis en bewaar bij -80 °C. LWRN complete media: Combineer 25 ml LWRN-media met 25 ml basismedia en vul aan met 200 ng/ml epidermale groeifactor (EFG) (20μL) en 2x antibioticum-antimycotische oplossing (1 ml). Bewaar de volledige media bij 4 °C. Collageen en laminine: Los 5 mg poeder op in 5 ml gesteriliseerd filter 100 mM azijnzuur (voeg 60 μL azijnzuurvoorraad toe aan 9,94 ml water van moleculaire kwaliteit) om een voorraadconcentratie van 1 mg/ml te produceren. Draai bij 4 °C gedurende 4 uur en maak 100 μL aliquots in buizen van 0,2 ml. Vries in bij -20 °C. Laminine wordt gekocht bij een voorraadconcentratie van 100 μg/ml. Complete media zonder groeifactoren (CMGF-): Supplement Advanced DMEM/F12 (500 ml) met 1x in de handel verkrijgbaar glutaminesupplement (5 ml), 10 ml HEPES (5 ml), 100 U/ml penicilline en 100 g/ml streptomycine (5 ml). Differentiatiemedia: Voeg aan 9,2 ml CMGF-media 200 μL B27-supplement, 100 μL N2-supplement, 20 μL N-acetyl-L-cysteïne, 500 μL Noggin-media12 (gemaakt van Noggin-producerende cellen) en 2 μL EFG toe om 10 ml differentiatiemedia te maken. 2. Voorbereiding van platen, kamerglijbanen en celkweekmembraaninzetstukken Coating 48-put plaat en kamerglijbanen voor het plateren van 2D monolayer: Gebruik de coatingoplossing die laminine (1:40 verdunning, zie Tabel van Materialen)en collageen (1:30 verdunning) vormt in koude Dulbecco’s Fosfaat gebufferde zoutoplossing, met Ca2+ en Mg2+ (DPBS). Voeg 200 μL coatingoplossing toe aan elke put en incubeer de plaat/kamerschuif in een CO2-incubator van 5% bij 37 °C gedurende ten minste 2 uur. Coating 0,4 μm celkweekmembraan inserts: Maak 1:30 verdunning van collageen in moleculair water en voeg 200 μL toe aan elke insert. Houd de plaat met de membraaninzet gedurende 30 minuten op ijs bij 4 °C. Na 30 minuten incubatie, houd de plaat in een 5% CO2 incubator bij 37 °C gedurende 1,5-2 uur. Polyester en polycarbonaat membraan inzetstukken leveren vergelijkbare resultaten op.OPMERKING: Elke weefselkweekplaat kan worden gezaaid (omhoog en omlaag kan worden gezaaid) met behulp van dit protocol door het collageen/ lamininevolume aan te passen om volledige dekking van het platingoppervlak te verkrijgen. 3. Crypte isolatie OPMERKING: Voordat u met de dissectie begint, moet u collageen en/of laminine gecoate plaat/membraaninzetstukken/kamerschuif bereiden en in een couveuse van 5% CO2 bij 37 °C laten staan. Bereid een schone werkbank en steriele chirurgische instrumenten voor die geschikt zijn voor chirurgie, en een biologische veiligheidskast voor het cultiveren van 2D-monolagen. Controleer of alle andere standaarduitrusting voor 2D-monolaagse cultivering, zoals bevochtigde CO2-incubator, tafelcentrifuges (onderhouden bij 4 °C), microscoop en pipetten (inclusief serologische pipetten) klaar zijn. Gebruik C57Bl/6 muizen, 8-12 weken oud. Euthanasie van muizen met behulp van een goedgekeurde methode van euthanasie. Besproei de karkassen van muizen met 70% ethanol (EtOH) oplossing om het dissectiegebied schoon te maken en overtollige EtOH te verwijderen met behulp van papierweefsel.OPMERKING: Zorg ervoor dat de crypte-isolatiereagentia (zoals PBS, 50 mM EDTA, schudbuffer) crypten koud worden gehouden. Deze reagentia kunnen een dag van tevoren worden bereid en zijn goed te gebruiken gedurende ten minste 3 maanden wanneer ze bij 4 °C worden bewaard. Zorg er ook voor dat de LWRN complete media tot gebruik in een kraal/waterbad bij 37 °C worden bewaard. Ontleed met een schone dissectieschaar en tang de dikke darm van het rectum naar het cecum. Houd het uiteinde van de dikke darm vast met een tang en spoel de ontlasting heel voorzichtig af met behulp van ijskoud PBS in een spuit van 10 ml, uitgerust met een voedingsbuis van 20 G (figuur 1A). Zorg ervoor dat u de dikke darm niet scheurt. Verwijder de proximale dikke darm. Dit is het deel van de dikke darm dat het dichtst bij de ileocecal junction ligt. Schuif met een tang de distale dikke darm voorzichtig op de 20 G-voedingsbuis enbind de dikke darm aan het einde van de buis af met de punt met 4-0 zijden hechtdraad(afbeelding 1B). Keer de dikke darm binnenstebuiten met de vingers over het uiteinde vastgebonden en bind het andere uiteinde vast met 4-0 zijden hechtdraad. Snijd met behulp van een chirurgische schaar de dikke darm onder de punt van de voedingsbuis(figuur 1C,D, E). Open met behulp van de zuiger van een herhaalspuit van 1,25 ml voorzichtig het losgemaakte uiteinde van de omgekeerde dikke darm op de punt van een herhaalspuit van 1,25 ml. Schuif de omgekeerde dikke darm op het uiteinde van de spuit en bind stevig vast met 4-0 zijden hechtdraad(afbeelding 1F, G). Steek de zuiger in de spuit en blaas de dikke darm op tot een worst. Blaas op tot de darmworst er turgent uitziet zonder zichtbare rimpels(figuur 1H). Plaats de spuit/dikke darm in een buis van 15 ml met 5 ml celhersteloplossing gedurende 20 minuten op ijs, blaas de dikke darm eens in de 5 minuten op en laat deze leeglopen (figuur 1I). De worst moet tijdens de incubatie opgeblazen blijven. Bind af met 4-0 zijden hechtdraad onder de punt van de herhaalspuit met de dikke darm opgeblazen. Snijd de worst van de herhaalspuit en plaats deze in een buis van 15 ml met 10 ml 50 mM (2 mM voor de dunne darm) EDTA gedurende 40 minuten en draai bij 4 °C(figuur 1J, K). Decanteer de EDTA-oplossing en vervang deze door 5 ml schudbuffer. Schud de worst 2 min. handmatig in verticale positie (krachtig). Decanteer de schudoplossing in een nieuwe buis van 15 ml en herhaal de schudstap voor in totaal 10 ml crypten in de schudbuffer. Neem 20 μL van de crypte suspensie in een petrischaal en tel het aantal crypten onder een microscoop. Bereken de crypteconcentratie in crypten/μL. Verdun de monsters afhankelijk van de concentratie om 5 crypten/μL te verkrijgen op het moment van plateren (1000 crypten/cm2). Draai de buis met geïsoleerde crypten met behulp van tafelbladcentrifuge op 400 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C. Verwijder ondertussen de 48-put plaat/insert/kamerschuif uit de incubator en plaats deze in de bioveiligheidskast. Aspireer de coatingoplossing met P200 en laat de plaat met het deksel iets verschoven totdat de cellen klaar zijn om te worden geplateerd. 4. Cultiveren van 2D monolaag OPMERKING: Voor een gedetailleerd protocol over het genereren van intestinale epitheliale monolagen uit 3D-colonoïden, controleert u protocollen van Estes en Kovbasnjuk labs (7,11). Verwijder de schudbuffer met een serologische pipet van 10 ml. Zorg ervoor dat de pellet intact is en gebruik P1000 om de overgebleven vloeistof te verwijderen. Hang de pellet opnieuw op in 3 ml LWRN complete media en pipet op en neer met P1000. Voeg 200 μL crypten toe aan elke put van een voorgecoate 48-put plaat/kamerschuif en incubeer in een CO2-incubator van 5% bij 37 °C. De volgende dag aspireren de media met behulp van P200 en voeg nieuwe media toe. De cellen worden samenvloeiend in 24-48 uur. Voeg voor celkweekmembraaninzetstukken 200 μL crypten (5 crypten/μL) toe aan de bovenkant van de inserts en 600 μL volledige L-WRN-media aan het onderste deel. De volgende dag aspireren de media met behulp van P200 en voeg alleen nieuwe media toe aan de bovenste kamer. Incubeer de plaat in een CO2 incubator van 5% bij 37 °C. Transepitheliale elektrische weerstand (TEER) wordt elke dag gemeten met behulp van epitheliale volt / ohm meter (EVOM).OPMERKING: Als de cultuur een TEER-meting van meer dan 300Ω,cm 2heeft, zijn ze bedoeld om samen te komen. Confluency wordt bereikt in 3-4 dagen. Verander elke 2 dagen van medium.