جيل من المورين الأولي القولون الظهارية Monolayers من سرداب الأمعاء
Summary
في هذا البروتوكول، ونحن نصف كيفية توليد المورين الأولية أحادية القولون الظهارية مباشرة من سرداب الأمعاء. نحن نقدم النهج التجريبية لتوليد monolayers التقاء على مرشحات نفاذية، monolayers التقاء لتضميد الجروح الصفر والدراسات الكيميائية الحيوية، و أحادية الطبقات متناثرة والتقاء لتحليل immunofluorescence.
Abstract
تتكون ظهارة الأمعاء من طبقة واحدة من الخلايا التي تعمل كحاجز بين تجويف الأمعاء وداخل الجسم. اضطراب في استمرارية هذا الحاجز يمكن أن يؤدي إلى اضطرابات التهابية مثل مرض التهاب الأمعاء. كان أحد القيود في دراسة البيولوجيا الظهارية المعوية هو عدم وجود نماذج أولية زراعة الخلايا ، مما اضطر الباحثين إلى استخدام خطوط الخلايا النموذجية المستمدة من الأورام. وقد أعطى ظهور المعويات ثلاثية الأبعاد (3D) علماء الأحياء الظهارية أداة قوية لتوليد ثقافات الخلايا الأولية ، ومع ذلك ، فإن هذه الهياكل مضمنة في مصفوفة خارج الخلية وتفتقر إلى سمة النضج للخلايا الظهارية المعوية المتمايزة. وقد نشرت عدة تقنيات لتوليد monolayers الظهارية المعوية، ولكن معظمها مستمدة من enteroids 3D المنشأة مما يجعل العملية شاقة ومكلفة. هنا نحن نصف بروتوكول لتوليد أحاديات القولون الظهارية الأولية مباشرة من سرداب الأمعاء مورين. نحن أيضا تفاصيل النهج التجريبية التي يمكن استخدامها مع هذا النموذج مثل توليد الثقافات التقاء على مرشحات نفاذية، أحادية التقاء لدراسات التئام الجروح الصفر و أحادية متناثرة والتقاء لتحليل immunofluorescence.
Introduction
الخلايا الظهارية المعوية (IEC) خط الأمعاء تشكيل حاجز نفاذية انتقائية التي تسمح امتصاص المواد الغذائية والمياه في حين منع الكائنات الحية الدقيقة والسموم لدخول الجسم 1. تتكون الغشاء المخاطي المعوي من إسقاطات مضيئة تسمى الزغب (موجودة فقط في الأمعاء الدقيقة) والتشنجات المسماة سرداب. وتغطي سيلي وسطح سرداب القولون من قبل الخلايا الظهارية المتمايزة في حين أن قاعدة السراديب تتكون من الخلايا الجذعية التي تجعل التجديد السريع للظهارة المعوية، والتي لديها دوران من 3 إلى 7 أيام. الخلايا الجذعية المعوية (ISC) ليست مهمة فقط للحفاظ على التوازن الأمعاء ولكن لإصلاح كاف من الظهارة التالفة2.
كانت دراسة بيولوجيا الظهارة المعوية محدودة بسبب عدم وجود ثقافات الخلايا الأولية مع خطوط الخلايا المحولة كونها الأداة الوحيدة المتاحة. خطوط الخلايا الظهارية المعوية ليست قادرة على تكرار بدقة فسيولوجيا الظهارة المعوية العادية. تطوير الثقافات ثلاثية الأبعاد المستمدة من مركز خدمات التصلب العصبي الداخلي قدمت علماء الأحياء المخاطية المعوية مع نماذج في المختبر التي تشبه في ظروف المخاطية الأمعاء في الجسم الحي3. يمكن عزل السراديب بسهولة من عينات مورين ، جزءا لا يتجزأ من وسط مصفوفة غشاء الطابق السفلي (على سبيل المثال ، Matrigel) وتزرع في وسائط مكيفة تحتوي على Wnt3a ، R -spondin ، و Noggin ، مما يولد هياكل ثلاثية الأبعاد تعرف باسم enteroids (الأمعاء الدقيقة) أو colonoids (الأمعاء الغليظة)4. المعويات والقولونات هي هياكل كروية مستقطبة حيث يواجه المجال apical تجويف داخلي والمنطقة القاعدية على اتصال مباشر مع المصفوفة خارج الخلية. Enteroids و colonoids تحتوي على جميع الأنواع الفرعية الظهارية المعوية المتمايزة الرئيسية مثل Enterocytes / Colonocytes ، Paneth ، Enteroendocrine وخلايا Goblet وتظهر بنفس النسب نسبيا كما هي الحال في قسم القناة الهضمية حيث تم عزلها من5. على الرغم من أن المعويات 3D والقولون تمثل تقدما كبيرا في دراسة التطور المعوي وعلم وظائف الأعضاء، وهذه النماذج تمثل بعض العيوب مثل الوصول المحدود إلى السطح apical من الخلايا الظهارية (التجويف) والقدرة على توسيع نطاق الثقافات صعودا أو أسفل لتحقيق فحص الإنتاجية العالية من الجزيئات ذات الأهمية. للتغلب على هذه القيود، تم إنشاء بروتوكولات للحصول على الثقافات 2D الأولية من IEC المستمدة من enteroids 3D / colonoids. 2D enteroids / colonoids تنمو ورقة من الخلايا تماما كما تفعل خطوط الخلايا النموذجية ومثالية لدراسة إصلاح الجروح المعوية ، والتفاعلات المضيفة الممرضة ، والطب التجديدي من بين أمور أخرى. تصف العديد من الأوراق المنشورة كيفية توليد أحاديات الأبعاد 2D من هياكل ثلاثية الأبعاد أو مباشرة من سرداب الأمعاء ، (انظر6،7،8،9،10،11)ولكن هذه الأساليب تميل إلى أن تكون كثيفة العمالة ويصعب إعادة إنتاجها. يتم تحديد طريقة سريعة وبسيطة وقابلة للاستنساخ للحصول على طبقات أحادية مباشرة من سرداب الأمعاء الماوس معزولة حديثا في هذا البروتوكول.
هنا نشرح بالتفصيل عملية استخراج سرداب مع الحد الأدنى من توليد الحطام، واختيار مصفوفة خارج الخلية والأسطح والتطبيقات المختلفة لهذه التقنية. تم تحسين هذا النهج التجريبي لأ وسرداب القولون ، ولكن يتم الحصول على نتائج مماثلة عند تطبيقها على الأمعاء الدقيقة.
Protocol
Representative Results
Discussion
يوفر بروتوكولنا طريقة سريعة وقابلة للاستنساخ وموثوقة لتوليد طبقات أحادية أولية مباشرة 2D IEC. واحدة من الاختلافات الرئيسية في بروتوكولنا مقارنة مع البروتوكولات المنشورة سابقا لتوليد monolayers الظهارية القولون هو أننا لا قطع القولون في قطع صغيرة لتحرير السراديب. بدلا من ذلك، قمنا بتكييف بروتوكول لفصل ظهارة الأمعاء من mesenchyme13 بواسطة مزيج من القوى الكيميائية والميكايكية لإطلاق سرداب في إعداد نظيف للغاية،(الشكل 2)،وتوفير الباحث مع المواد المثالية لتوليد الثقافات الأولية. يمكن استخدام طريقة العزل لدينا أيضا لتوليد enteroids 3D والقولون. من المهم القيام بعدد سرداب في كل مرة يتم فيها إجراء تجربة لتطبيع عدد سرداب التي يتم صفيحها. المتغيرات مثل تورغور نقانق القولون، وسرعة العزلة، وخبرة المستخدم يمكن أن تؤثر على عدد من سرداب معزولة. إن تركيز سرداب الطلاء المقترح المذكور في البروتوكول هو نقطة انطلاق ، ولكن يجب على كل مستخدم لحساب المتغيرات التي يحركها المستخدم تحسينه. لقد استخدمنا هذه التقنية مع الفئران WT الذكور والإناث تتراوح بين 8 إلى 20 أسبوعا، ونحن لم نر اختلافات كبيرة في بقاء الخلية، من الناحية النظرية سرداب معزولة عن الفئران الأصغر سنا لديها فرص أفضل للبقاء على قيد الحياة. يتم صفيح سرداب في الزائدة كما نسبة صغيرة فقط منهم نعلق على السطح والبقاء على قيد الحياة. التوازن حيث هناك ما يكفي من السراديب أن يكون لها التقاء 50٪ بعد يوم واحد من الطلاء ولكن ليس الكثير من سرداب حيث السرداب الموت سيكون لها تأثير السامة للخلايا هو الهدف. يجب إزالة وسائط LWRN بعناية بعد 24 ساعة من الطلاء للقضاء على سرداب وحطام ميت ، ويجب أن يتم ذلك بعناية لتجنب فصل الخلايا التي تنمو بالفعل كقاتل أحادي.
بعد الإزالة الأولية لوسائط LWRN ، يجب على المستخدم أن يقرر ما إذا كانت الظروف التجريبية تتطلب طبقات أحادية أساسية في IEC تبقى أقرب إلى الخلايا الجذعية وإضافة وسائط LWRN جديدة أو إذا كان التمايز بين الطبقة الأحادية مرغوبا فيه ، واستبدالها بوسائط تمايز. العامل الوحيد الأكثر أهمية في هذا البروتوكول هو ضمان سلامة القولون أثناء عملية العزل. إذا حدث تمزق، يمكن تقصير النقانق للقضاء على المنطقة المتضررة. قبل وضع النقانق في EDTA تأكد من أن العقد ضيقة قدر الإمكان. إذا تم تفريغ النقانق بعد حضانة EDTA يمكن الاستمرار في البروتوكول مع تأثير ضئيل أو معدوم في العائد العام سرداب. إذا لم تكن الحقنة المتكررة متوفرة ، يمكن أيضا استخدام طرف ميكروبايت منتظم متصل بحقنة منتظمة لعملية التضخم والانكماش. أيضا، إذا لم يكن هناك حل استعادة الخلية المتاحة، يمكن القيام به التضخم والانكماش الخطوات في EDTA (2mM الأمعاء الدقيقة، 50 mM القولون)، ولكن لا ينصح هذا الاستبدال. إذا لم يكن هناك حاجة إلى التقاء، يمكن أن تنمو سرداب في لوحات المغلفة فقط مع الكولاجين وحتى في لوحات غير المصقول. فقط استخدام الحالات لوحات غير المصقول لا يوجد خيار آخر، ولكن الخلايا لن تنمو صحية كما هو الحال في لوحات المغلفة بالكولاجين. عندما يتعلق الأمر بالصحة الثقافية والاستقرار، فإن الطبقات الأحادية المطلية بالبلاستيك صحية لمدة 4 إلى 5 أيام في حين يمكن حمل الطبقات الأحادية المطلية في transwells لمدة تصل إلى 8 أيام.
واحدة من القيود الرئيسية لهذه الطريقة هي وسائط الخلية المطلوبة لزراعة أحاديات القولون الظهارية. تتوفر خلايا LWRN في ATCC ، ولكن توليد الوسائط المكيفة LWRN كثيف العمالة ويتطلب الوصول إلى مطياف فلوري لتحديد نشاط Wnt. تتطلب وسائط التمايز عددا من الكواشف التي يتم إضافتها طازجة قبل الاستخدام ، مما يجعلها عملية مملة. وأخيرا، فإن معظم هذه الكواشف مكلفة وسهلة لحرق الكواشف بوتيرة سريعة. إذا كان المختبر يرغب في إنشاء هذه التقنية دون ثقافة الخلايا الأولية المعوية السابقة ، فمن المستحسن للغاية العثور على متعاون / كلية لديه خبرة وتدريب أحد أعضائه.
يمكن أن تكون صيانة الثقافة ثلاثية الأبعاد مكلفة بسبب تكلفة مصفوفة غشاء الطابق السفلي المتوسطة والأحجام العالية من الوسائط المكيفة اللازمة للثقافات العضوية ، ولكن لديها ميزة استخدام عدد أقل من الفئران ويمكن تمرير الهياكل المولدة عدة مرات. المعويات (المستمدة من الأمعاء الدقيقة) من السهل نسبيا لعزل والحفاظ على حين القولون هي أكثر حساسية، وتنمو بوتيرة أبطأ ولها قدرة مرور أكثر محدودية. جيل أحادي الطبقة من colonoids 3D تتطلب كمية غير متناسبة من الهياكل 3D، التي تجعل هذه الأنواع من التجارب تستغرق وقتا طويلا ومكلفة. على العكس من ذلك، الإعدادية القولون الظهارية مباشرة أحادية الطبقة سريع وطريقة سريعة للحصول على النتائج. يمكن أن تولد الإعدادية القولون واحد منطقة التقاء من 75 سم2 (10 إلى 15 مل من وسائل الإعلام مشروطة، يستبدل مرة واحدة) 2 إلى 3 أيام بعد الطلاء (هذه المنطقة تتطلب 144 بئرا من colonoids 3D، وهو ما يعني ما يقرب من 6mL من Matrigel وأكثر من 250 مل من وسائل الإعلام مشروطة). انخفاض استهلاك وسائل الإعلام، وانخفاض تكلفة الحفاظ على ثقافة الخلية والقدرة على إجراء اختبارات وظيفية ومعالجة المصب السريع هي مزايا كبيرة من monolayers القولون الظهارية.
هذا البروتوكول هو أداة قيمة في دراسة بيولوجيا الخلايا الظهارية المعوية في مجالات مثل التصاق الخلايا، والقطبية، والتمايز. فهو يعطي ميزة لتوليد ثقافات الخلايا الأولية من الفئران المعدلة وراثيا (خروج المغلوب، التعبير المفرط، المراسلين). تسمح الطبقات الأحادية الظهارية المعوية الأولية بسهولة الوصول إلى الأسطح القاعدية والبازلية (عندما تكون مطلية على transwells) مما يسمح بدراسة النفاذية والحاجز والهجرة عبر الظهارية لأنواع مختلفة من الخلايا. وأخيرا، يمكن أن يكون هذا النموذج مفيدا في مجالات مختلفة مثل تفاعلات مسببات الأمراض المضيفة، والضرر الظهاري، والإصلاح واكتشاف الأدوية.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا العمل من خلال جائزة التطوير الوظيفي لمؤسسة كرون والتهاب القولون (544599 ، إلى MQ) ومنح المعاهد القومية للصحة (DK055679 ، DK089763 ، DK059888 ، إلى AN). نود أن نشكر مختبر ميشيغان لنمذجة الأنسجة المترجمة للطب على مساعدتهم المستمرة والوصول إلى الكواشف والبروتوكولات الخاصة بهم.
Materials
| Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634-010 | |
| Antibiotic Antimycotic solution | Corning | 30-004CI | |
| B27 supplement (50X) | Gibco | 12587-010 | |
| Cell Recovery Solution | Corning | 354253 | |
| Collagen from human placenta (type IV) | Sigma-Aldrich | C5533 | |
| D-Sorbitol | Sigma | 85529-250G | |
| D-Sucrose | Fisher Scientific | BP220-1 | |
| Dulbecco’s phosphate buffered saline, with Ca2+ and Mg2+ (DPBS) | Corning | 21-030-CV | |
| Epithelial Volt/Ohm meter | World Precision Instruments | 0-10KΩ with STX2 (EVOM2) | |
| Ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA) | Lonza | 51201 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Corning | 35-016-CV | |
| Firefly Luciferase assay | Biotium | 30085-2 | |
| Geneticin | Gibco | 10131-035 | |
| GlutaMAX (100X) | Gibco | 35050-061 | |
| HEPES (1M) | Corning | 25060CI | |
| Human recombinant EGF | R&D systems | 236-EG | Stock Concentration: 500µg/mL |
| Human recombinant Wnt-3A | R&D systems | W3a-H-005 | |
| Hygromycin B | Invitrogen | 10687010 | |
| LWRN cells | ATCC | CRL-3276 | |
| Molecular grade water | Corning | 46-000-CV | |
| N2 supplement (100X) | Gibco | 17502-048 | |
| N-acetyl-L-cysteine | Sigma-Aldrich | A9165-5G | Stock Concentration: 500mM |
| Noggin | Conditioned media | – | |
| Nunc Lab-Tek Chamber slide system | Sigma-Aldrich | C7182-1PAK | |
| Pencillin-Streptomycin (10,000U/mL) | Corning | 30002CI | |
| Phospahte buffered saline, Ca2+ and Mg2+ free (PBS) | Corning | 21-040-CV | |
| Plastic 20G feeding tube | Fisher Scientific | 50-810-46 | |
| rh-laminin-521 | Gibco | A29248 | Stock concentration: 100µg/mL |
| Roboz Surgical 4-0 Silk Black Braided 100YD | Fisher Scientific | NC9452680 | |
| TOPflash HEK293 cells | ATCC | CRL-3249 | |
| Transwell Permeable supports (0.4µm) | Corning | 3470 |
References
- Quiros, M., Nusrat, A. Contribution of wound-associated cells and mediators in orchestrating gastrointestinal mucosal wound repair. Annual Reviews in Physiology. 81, 189-209 (2019).
- Blutt, S. E., et al. Use of organoids to study regenerative responses to intestinal damage. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 317 (6), 845-852 (2019).
- Zhang, M., Liu, Y., Chen, Y. G. Generation of 3D human gastrointestinal organoids: principle and applications. Cell Regeneration. 9 (1), 6 (2020).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Zachos, N. C., et al. Human enteroids/colonoids and intestinal organoids functionally recapitulate normal intestinal physiology and pathophysiology. Journal of Biological Chemistry. 291 (8), 3759-3766 (2016).
- Kozuka, K., et al. Development and characterization of a human and mouse intestinal epithelial cell monolayer platform. Stem Cell Reports. 9 (6), 1976-1990 (2017).
- In, J. G., Foulke-Abel, J., Clarke, E., Kovbasnjuk, O. Human colonoid monolayers to study interactions between pathogens, commensals, and host intestinal epithelium. Journal of Visualized Experiments. (146), e59357 (2019).
- Cardenas, D., et al. Two- and three-dimensional bioengineered human intestinal tissue models for cryptosporidium. Methods in Molecular Biology. 2052, 373-402 (2020).
- Moon, C., VanDussen, K. L., Miyoshi, H., Stappenbeck, T. S. Development of a primary mouse intestinal epithelial cell monolayer culture system to evaluate factors that modulate IgA transcytosis. Mucosal Immunology. 7 (4), 818-828 (2014).
- VanDussen, K. L., et al. Development of an enhanced human gastrointestinal epithelial culture system to facilitate patient-based assays. Gut. 64 (6), 911-920 (2015).
- Zou, W. Y., et al. Human intestinal enteroids: New models to study gastrointestinal virus infections. Methods in Molecular Biology. 1576, 229-247 (2019).
- Heijmans, J., et al. ER stress causes rapid loss of intestinal epithelial stemness through activation of the unfolded protein response. Cell Reports. 3 (4), 1128-1139 (2013).
- Nik, A. M., Carlsson, P. Separation of intact intestinal epithelium from mesenchyme. Biotechniques. 55 (1), 42-44 (2013).
