Geração de Monócamas Epiteliais de Cólon Primário Murine de Criptas Intestinais

Todos os procedimentos descritos abaixo foram aprovados e conduzidos de acordo com as diretrizes estabelecidas pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Michigan. 1. Preparação de reagentes para isolamento e cultura cripta (prepare-se na capa da cultura tecidual) 50 mM de ácido tetraáctico de etilenodiamina (EDTA): Adicione 50 mL 0,5 M de estoque a 450 mL de salina tamponada de fosfato, sem cálcio (Ca2+) e magnésio (Mg2+) para preparar 500 mL. Neste protocolo, a PBS se referirá à PBS sem cálcio e magnésio, a menos que seja indicado de outra forma. Tampão de agitação: Dissolva 7,4 g de sacarose (43,3 mM) e sorbitol de 5 g (54,9 mM) em PBS para preparar 500 mL. L-WRN (L-WNT-3A, R-spondin e Noggin) mídia: Suplemento Avançado Dulbecco’s Modified Eagle Medium/Ham’s F-12 (DMEM/F12) (780 mL) com 20% de Soro Bovino Fetal (FBS) (200 mL), 1x suplemento de glutamina comercialmente disponível (10 mL), penicilina U/mL 100 E, Estreptomicina de 100 g/mL (10 mL) e filtro esterilizado com filtro de 0,22 μm. Obter células L-WRN através de ATCC, crescer em frascos T175, e selecionar usando Geneticin e Hygromycin. A mídia é alterada e coletada por 12 dias.NOTA: Cada lote de mídia é testado para a atividade Wnt usando um ensaio TOPflash Wnt Reporter. Neste caso, foram seguidos os protocolos do Laboratório de Modelagem de Tecidos Translacionais da Medicina de Michigan (https://www.umichttml.org/protocols). A linha de células TOPflash HEK 293 é cultivada em confluência em um frasco T75, trippsinizado e banhado em uma placa de 96 poços. No dia seguinte, diferentes diluições da mídia coletada são adicionadas às células e incubadas em uma incubadora de CO2 de 5% a 37 °C durante a noite. No dia seguinte, as células são lísedas, e o ensaio Firefly Luciferase é realizado de acordo com as instruções do fabricante. O ensaio é normalizado usando Wnt-3A recombinante. A mídia é dividida em alíquotas de 25 mL em tubos cônicos de 50 mL e armazena a -80 °C. Mídia base: Para 500 mL, suplemento Avançado DMEM/F12 (448 mL) com 2x suplemento de glutamina comercialmente disponível (10 mL), 20 mM HEPES (10 mL), 100 penicilina U/mL e, Estreptomicina de 100 g/mL (10 mL), 2 mM N-acetil-L-cisteína (2 mL), suplemento N2 (10 mL) e suplemento B27 (20 mL), esterilizador de filtro com filtro de 0,22 μm. Divida a mídia em alíquotas de 25 mL em tubo cônico de 50 mL e armazene a -80 °C. Mídia completa LWRN: Combine mídia LWRN de 25 mL com 25 mL de mídia base e suplemento com fator de crescimento epidérmico de 200 ng/mL (EGF) (20μL) e solução antimicolítica de 2x (1 mL). Armazene a mídia completa a 4 °C. Colágeno e Laminina: Dissolver 5 mg de pó em 5 mL de filtro esterilizado 100 mM de ácido acético (adicionar 60 μL de caldo de ácido acético a 9,94 mL de água de grau molecular) para produzir uma concentração de estoque de 1 mg/mL. Gire a 4 °C por 4 h e faça 100 alíquotas de μL em tubos de 0,2 mL. Congele a -20 °C. Laminin é comprado a uma concentração de estoque de 100 μg/mL. Mídia completa sem fatores de crescimento (CMGF-): Suplemento Avançado DMEM/F12 (500 mL) com 1x suplemento de glutamina comercialmente disponível (5 mL), 10 mM HEPES (5 mL), 100 U/mL penicilina e, 100 g/mL streptomicina (5 mL). Mídia de diferenciação: A 9,2 mL de cmgf-mídia, adicionar 200 μL de suplemento B27, 100 μL de suplemento N2, 20 μL de N-acetil-L-cisteína, 500 μL de mídia Noggin12 (feita de células produtoras de Noggin) e 2 μL de EGF para fazer 10 mL de mídia de diferenciação. 2. Preparação de placas, lâminas de câmara e inserções de membrana de cultura celular Revestimento de 48 poços de placa e lâminas de câmara para chapeamento monocamada 2D: Use a solução de revestimento que constitui diluição de laminina (diluição 1:40, ver Tabela de Materiais) e colágeno (diluição 1:30) em salina fosfato a frio de Dulbecco, com Ca2+ e Mg2+ (DPBS). Adicione 200 μL de solução de revestimento a cada poço e pré-incubar o slide de placa/câmara em uma incubadora de 5% de CO2 a 37 °C por pelo menos 2 h. Revestimento de 0,4 μm de membrana de cultura celular inserções: Faça 1:30 diluição de colágeno em água de grau molecular e adicione 200 μL a cada inserção. Mantenha a placa contendo a inserção da membrana no gelo a 4 °C por 30 minutos. Após a incubação de 30 min, mantenha a placa em uma incubadora de CO2 de 5% a 37 °C por 1,5-2 h. As inserções de poliéster e membrana de policarbonato produzem resultados comparáveis.NOTA: Qualquer placa de cultura tecidual pode ser semeada (para cima e para baixo pode ser realizada) usando este protocolo ajustando o volume de colágeno/laminina para obter cobertura completa da superfície de chapeamento. 3. Isolamento da cripta NOTA: Antes de iniciar a dissecção, prepare a placa revestida de colágeno e/ou laminina/inserções de membrana/deslizamento de câmara e deixe-os em uma incubadora de CO2 de 5% a 37 °C. Prepare um banco de trabalho limpo e instrumentos cirúrgicos estéreis apropriados para a cirurgia, e um gabinete de segurança biológica para cultivar monocamadas 2D. Confirme todos os outros equipamentos padrão para cultivo de monocamadas 2D, como incubadora de CO2 umidificada, centrífugas de mesa (mantidas a 4 °C), microscópio e pipetas (incluindo pipetas sorológicas) estão prontas. Use ratos C57Bl/6, 8-12 semanas de idade. Eutanásia de camundongos usando um método aprovado de eutanásia. Pulverize as carcaças de camundongos com 70% de etanol (EtOH) solução para limpar a área de dissecção e remover o excesso de EtOH usando tecido de papel.NOTA: Certifique-se de que as criptes de isolamento da cripta (como PBS, 50 mM EDTA, shake buffer) são mantidas frias. Estes reagentes podem ser preparados um dia antes e são bons de usar por pelo menos 3 meses quando armazenados a 4 °C. Além disso, certifique-se de que a mídia completa LWRN seja mantida em um banho de contas/água mantido a 37 °C até o uso. Usando tesouras de dissecção limpa e fórceps, disseca o cólon do reto até o ceco. Segure a extremidade do cólon usando fórceps e limpe suavemente as fezes usando PBS gelado em uma seringa de 10 mL, equipada com um tubo de alimentação de 20 G(Figura 1A). Certifique-se de não romper o cólon. Remova o cólon proximal. Esta será a porção do cólon mais próxima da junção ileocecal. Com fórceps, deslize o cólon distal suavemente para o tubo de alimentação de 20 G, amarrando o cólon na extremidade do tubo pela ponta com fio de sutura de seda 4-0(Figura 1B). Inverta o cólon do avesso usando os dedos sobre a extremidade amarrado e amarre a outra extremidade com fio de sutura de seda 4-0. Utilizando tesoura cirúrgica, corte o cólon abaixo da ponta do tubo de alimentação (Figura 1C, D,E). Usando o êmbolo de uma seringa repetida de 1,25 mL, abra suavemente a extremidade desamaste do cólon invertido na ponta de uma seringa repetida de 1,25 mL. Deslize o cólon invertido na extremidade da seringa e amarre firmemente com rosca de sutura de seda 4-0(Figura 1F,G). Insira o êmbolo na seringa e infle o cólon para formar uma salsicha. Infle até que a linguiça de cólon pareça turgente sem rugas visíveis(Figura 1H). Coloque a seringa/cólon em tubo de 15 mL com 5 mL de Solução de Recuperação celular no gelo por 20 minutos, infle e desinte com o cólon uma vez a cada 5 minutos(Figura 1I). A salsicha deve permanecer inflada durante a incubação. Amarre usando fio de sutura de seda 4-0 abaixo da ponta da seringa repetida com o cólon inflado. Corte a linguiça da seringa repetida e coloque em tubo de 15 mL contendo 10 mL de 50 mM (2mM para intestino delgado) EDTA por 40 min e gire a 4 °C(Figura 1J,K). Decante a solução EDTA e substitua por 5 mL de tampão de shake. Agite a salsicha manualmente na posição vertical (vigorosamente) por 2 minutos. Decante a solução de agitação em um novo tubo de 15 mL e repita o passo de agitação para um total de 10 mL de criptas em tampão de agitação. Pegue 20 μL da suspensão da cripta em uma placa de Petri e conte o número de criptas sob um microscópio. Calcule a concentração de cripta em criptas/μL. Dependendo da concentração, dilui as amostras para obter 5 criptas/μL no momento do revestimento (1000 criptas/cm2). Gire o tubo com criptas isoladas usando centrífuga de mesa a 400 x g por 10 min a 4 °C. Enquanto isso, remova o deslizamento de placa/inserção/câmara de 48 poços da incubadora e coloque-o no armário de biossegurança. Aspire a solução de revestimento usando P200 e deixe a placa com a tampa ligeiramente compensada até que as células estejam prontas para serem banhadas. 4. Culturing monocamadoreira 2D NOTA: Para um protocolo detalhado sobre como gerar monocamadas epiteliais intestinais a partir de colonóides 3D, verifique os protocolos dos laboratórios de Estes e Kovbasnjuk (7,11). Remova o tampão de agitação usando pipeta sorológica de 10 mL. Certifique-se de que a pelota está intacta e pode usar P1000 para remover qualquer líquido restante. Suspenda a pelota em 3 mL de mídia completa LWRN e pipeta para cima e para baixo com P1000. Adicione 200 μL de criptas a cada poço de um slide de placa/câmara pré-revestido de 48 poços e incubar em uma incubadora de 5% de CO2 a 37 °C. No dia seguinte, aspire a mídia usando P200 e adicione mídia fresca. As células ficam confluentes em 24-48 h. Para inserções de membrana de cultura celular, adicione 200 criptas μL (5 criptografas/μL) ao topo das pastilhas e 600 μL de mídia L-WRN completa à parte inferior. No dia seguinte, aspire a mídia usando P200 e adicione mídia fresca apenas à câmara superior. Incubar a placa em uma incubadora de CO2 de 5% a 37 °C. A Resistência Elétrica Transepitenelial (TEER) é medida todos os dias usando o medidor Epitelial Volt/Ohm (EVOM).NOTA: Se a cultura tem uma leitura TEER superior a 300 Ω,cm2,elas devem ser confluentes. A confluência é alcançada em 3-4 dias. Mudar de mídia a cada 2 dias.