腸管内窩からのネズミ原発結上皮単層の生成

以下に記載されているすべての手順は、ミシガン大学の制度的動物管理および使用委員会が定めたガイドラインに従って承認され、実施されています。 1. 暗号分離および培養用試薬の調製(組織培養フードで準備) 50 mM エチレンアミンテトラ酢酸 (EDTA): カルシウム(Ca2+)およびマグネシウム(Mg2+)を使用せずに、リン酸緩衝生理食塩水の450 mLに50 mL 0.5 Mストックを加え、500 mLを調製します。このプロトコルでは、PBSは特に明記されていない限り、カルシウムとマグネシウムを含まないPBSを参照します。 シェイクバッファー:PBSで7.4 gスクロース(43.3mM)と5gソルビトール(54.9mM)を溶解し、500 mLを調製します。 L-WRN (L-Wnt-3A, R-spondinおよびNoggin)メディア:サプリメント高度なダルベッコの修正イーグルミディアム/ハムのF-12(DMEM / F12)(780 mL)と20%の胎児血清(FBS)(200 mL)、1x市販のグルタミンサプリメント(10mL)、100 U/mL陰茎、および 100 g/mL ストレプトマイシン (10 mL) を、0.22 μm フィルターでフィルター滅菌します。 ATCCを介してL-WRN細胞を取得し、T175フラスコで成長し、ジェネティコリンとハイグロマイシンを使用して選択します。メディアは12日間変更され、収集されます。注:メディアのすべてのバッチは、TOPflash Wnt Reporterアッセイを使用してWntアクティビティについてテストされます。この場合、ミシガン医学トランスレーショナルティッシュモデリング研究所のプロトコル(https://www.umichttml.org/protocols)に従った。TOPflash HEK 293細胞株はT75フラスコで合流するように成長し、トリプシン化し、96ウェルプレートにメッキします。翌日、採取した培地の異なる希釈液が細胞に添加され、一晩で37°Cで5%CO2 インキュベーターでインキュベーターされる。翌日、細胞はリズされ、ホタルルシファーゼアッセイはメーカーの指示に従って行われます。このアッセイは、組換えWnt-3Aを用いて正規化される。メディアは50 mL円錐管で25 mLのアリコートに分けられ、-80°Cで貯蔵する。 ベースメディア:500 mL、2倍の市販のグルタミンサプリメント(10 mL)、20 mM HEPES(10 mL)、100 U/mLペニシリンと、サプリメント高度なDMEM / F12(448 mL) 100 g/mL ストレプトマイシン (10 mL), 2 mM N-アセチル-L-システイン (2 mL), N2 サプリメント (10 mL) および B27 サプリメント (20 mL), フィルター滅菌 0.22 μm フィルター.50 mL円錐管で25mLのアリコートにメディアを分割し、-80°Cで保管してください。 LWRN完全な媒体:25 mL LWRN培地を25 mLのベースメディアと組み合わせ、200 ng/mL表皮成長因子(EGF)(20μL)および2x抗生物質抗ミコティック溶液(1 mL)を補充します。4 °Cで完全なメディアを保管してください。 コラーゲンとラミニン:5mg粉末を100 mMの酢酸を殺菌したフィルターで5mL溶解し(酢酸ストック60 μLを分子グレード水の9.94 mLに加える)、1mg/mLのストック濃度を生成します。4°Cで4時間回転し、0.2 mLチューブで100 μLアリコートを作ります。-20°Cで凍結します。 ラミニンは、100 μg/mLの在庫濃度で購入されます。 成長因子を含まない完全な培地(CMGF-):1x市販のグルタミンサプリメント(5mL)、10 mM HEPES(5 mL)、100 U/mLペニシリン、および100 g/mLストレプトマイシン(5mL)を備えた、高度なDMEM/ F12(500mL)。 分化媒体:CMGF-培地の9.2 mLに、B27サプリメントの200 μL、N2サプリメントの100 μL、N-アセチルLシステインの20 μL、ノギン培地12 の500 μL(ノギン産生細胞から作られた)および2 μLのEGFを加えて、10mLの異なる培地を作る。 2. プレート、チャンバースライド、細胞培養膜挿入物の調製 めっき2Dモノレイヤー用の48ウェルプレートおよびチャンバースライドのコーティング:ラミニン(1:40希釈、材料表参照)とコラーゲン(1:30希釈)を冷たいダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水に、Ca2+およびMg 2+(DPBS)で構成するコーティング溶液を使用します。各ウェルに200 μLのコーティング溶液を加え、プレート/チャンバースライドを37°Cの5%CO2インキュベーターで2時間以上事前にインキュベートします。 コーティング 0.4 μm の細胞培養膜挿入: 分子グレードの水にコラーゲンを 1:30 希釈し、各インサートに 200 μL を加えます。膜インサートを含むプレートを氷上の4°Cで30分間保管します。30分間のインキュベーションに続いて、プレートを37°Cで1.5〜2時間、5%CO2インキュベーターに入れておいてください。ポリエステルとポリカーボネート膜挿入は、同等の結果をもたらす。注:任意の組織培養プレートは、このプロトコルを使用して、このプロトコルを使用して、めっき面の完全なカバレッジを得るためにコラーゲン/ラミニンの体積を調整することによってシード(上下スケーリングを行うことができます)することができます。 3. 暗号化の分離 注:解剖を開始する前に、コラーゲンおよび/またはラミニンコーティングされたプレート/膜インサート/チャンバースライドを準備し、37°Cの5%CO2 インキュベーターに残してください。 手術に適したクリーンワークベンチと無菌手術用器具、2D単層を培養するための生物学的安全キャビネットを用意します。加湿CO2 インキュベーター、卓上遠心分離機(4°Cで維持)、顕微鏡、ピペット(血清ピペットを含む)などの2D単層培養のための他のすべての標準装置を確認します。 生後8~12週のC57Bl/6マウスを使用してください。承認された安楽死法を用いてマウスを安楽死させる。 70%エタノール(EtOH)溶液でマウスの死体をスプレーし、解剖領域を洗浄し、紙組織を使用して余分なEtOHを除去する。メモ:暗号分離試薬(PBS、50 mM EDTA、シェイクバッファなど)が冷たく保たれていることを確認してください。これらの試薬は、1日前に調製することができ、4°Cで保存した場合、少なくとも3ヶ月間使用することが良好である。 また、LWRN完全な媒体は使用まで37°Cで維持されるビーズ/水浴に保たれていることを確認してください。 きれいな解剖はさみと鉗子を使用して、直腸から盲腸に結腸を解剖する。鉗子を使用して結腸の端を保持し、10 mLのシリンジで氷冷PBSを使用して非常に穏やかにフェースを洗い流し、20 Gの給餌管を取り付けた(図1A)。結腸を破裂させないようにしてください。 近位コロンを取り除きます。これは、イレオセカル接合部に最も近い結腸の部分になります。 鉗子で、遠位コロンを20Gの送電管にそっとスライドさせ、4-0シルク縫合糸で先端でチューブの端にある結腸を結ぶ(図1B)。 結ばれた端に指を使って結び、もう一方の端を4-0シルク縫合糸で結んで、結び返しコロンを裏返しにします。手術用ハサミを使用して、給餌管の先端の下にコロンを切断する(図1C、D、E)。 1.25 mLリピートシリンジのプランジャーを使用して、1.25 mLリピートシリンジの先端に反転結びコロンのアンタイドエンドをそっと開きます。反転したコロンをシリンジの端にスライドさせ、4-0シルク縫合糸でしっかりと結びます(図1F、G)。 プランジャーをシリンジに挿入し、結腸を膨らませてソーセージを形成します。コロンソーセージが目に見えるしわなしで急がいくなるまで膨らませる(図1H)。 5 mLの細胞回収液を入れた15 mLチューブに20分間、シリンジ/コロンを入れ、5分に1回、結腸を膨張して収縮させます(図1I)。ソーセージは、インキュベーション中に膨らませたままでなければなりません。 繰り返しシリンジの先端の下にある4-0シルク縫合糸を結び、結腸を膨らませます。ソーセージを切り落とし、50mM(小腸の場合は2mM)の10mLを含む15mLチューブに40分間、40分間回転させます(図1J、K)。 EDTA溶液をデカントし、5 mLのシェイクバッファーに交換します。ソーセージを縦位置(激しく)に2分間振ります。 新しい15 mLチューブに振る溶液をデカントし、振るバッファー内の納骨堂の合計10 mLの振盪ステップを繰り返します。 ペトリ皿に20μLのクリプトサスペンションを取り、顕微鏡での納骨堂の数を数えます。crypts/μLでの暗号濃度を計算します。 400 x g で 400 x g で 4 °C で 10 分間、分離した納骨堂でチューブをスピンします。 その間に、インキュベーターから48ウェルプレート/インサート/チャンバースライドを取り出し、バイオセーフティキャビネットに置きます。P200を用いてコーティング液を吸引し、細胞がめっきされる準備ができるまで蓋をわずかにオフセットしてプレートを残します。 4. 2D単層の培養 注:3Dコロノイドから腸の上皮単層を生成する方法についての詳細なプロトコルについては、エステスとKovbasnjukラボによってプロトコルをチェックします (7,11). 10 mL血清ピペットを使用して振るバッファーを取り外します。ペレットがそのままで、P1000を使用して残った液体を取り除くことを確認してください。P1000でLWRN完全な媒体およびピペットの3 mLでペレットを再中断する。事前にコーティングされた48ウェルプレート/チャンバースライドの各ウェルに200 μLのクリプトを加え、37°Cの5%CO2 インキュベーターでインキュベートします。 翌日、P200を使用してメディアを吸引し、新鮮なメディアを追加します。細胞は24-48時間でコンフルエントになる。 細胞培養膜挿入物の場合、挿入部の上部に200μLの暗号(5つの暗号/μL)を加え、完全なL-WRN培地を600μLの下端に加えます。翌日P200を使用してメディアを吸引し、新鮮なメディアを最上部にだけ追加します。プレートを37°Cで5%CO2 インキュベーターにインキュベートします。 上皮電気抵抗(TEER)は上皮ボルト/オームメーター(EVOM)を使用して毎日測定されます。注: カルチャに 300 Ω.cm2を超える TEER 読み取り値がある場合、それらはコンフルエントであることを意味します。合流は3-4日で達成される。メディアを 2 日ごとに変更します。