Generazione di monostrati epiteliali del colon primario murino da cripte intestinali

Tutte le procedure descritte di seguito sono state approvate e condotte in conformità con le linee guida stabilite dal Comitato istituzionale per la cura e l’uso degli animali dell’Università del Michigan. 1. Preparazione dei reagenti per l’isolamento e la coltura della cripta (preparati nella cappa di coltura tissutale) Acido tetraacetico di etilenediammina da 50 mM (EDTA): aggiungere 50 mL 0,5 M stock a 450 mL di salina tamponata con fosfato, senza calcio (Ca2+) e magnesio (Mg2+) per preparare 500 mL. In questo protocollo PBS farà riferimento a PBS senza calcio e magnesio se non diversamente indicato. Shake buffer: Sciogliere 7,4 g di saccarosio (43,3 mM) e 5 g di sorbitolo (54,9 mM) in PBS per preparare 500 mL. L-WRN (L-Wnt-3A, Supporti R-spondin e Noggin): Supplemento Advanced Dulbecco’s Modified Eagle Medium/Ham’s F-12 (DMEM/F12) (780 mL) con siero bovino fetale al 20% (FBS) (200 mL), 1x integratore di glutammina disponibile in commercio (10 mL), 100 U/mL penicillina e, 100 g/mL di streptomicina (10 mL) e filtrare la sterilizzazione con filtro da 0,22 μm. Ottenere cellule L-WRN attraverso ATCC, crescere in matracci T175 e selezionare utilizzando geneticina e igromicina. I supporti vengono modificati e raccolti per 12 giorni.NOTA: ogni lotto di supporti viene testato per l’attività Wnt utilizzando un test TOPflash Wnt Reporter. In questo caso sono stati seguiti i protocolli del Michigan Medicine Translational Tissue Modeling Laboratory (https://www.umichttml.org/protocols) . La linea cellulare TOPflash HEK 293 viene coltivata fino alla confluenza in un mascella T75, tripsinziata e placcata su una piastra da 96 poggia. Il giorno seguente diverse diluizioni del supporto raccolto vengono aggiunte alle cellule e incubate in un incubatore di CO2 del 5% a 37 °C durante la notte. Il giorno dopo, le cellule vengono lisciviate e il saggio Firefly Luciferase viene eseguito secondo le istruzioni del produttore. Il saggio viene normalizzato utilizzando il ricombinante Wnt-3A. Il supporto è diviso in aliquote da 25 ml in tubi conici da 50 ml e conserva a -80 °C. Supporti di base: Per 500 mL, supplemento Advanced DMEM/F12 (448 mL) con 2x integratore di glutammina disponibile in commercio (10 mL), 20 mM HEPES (10 mL), 100 U/mL penicillina e, 100 g/mL streptomicina (10 mL), 2 mM N-acetil-L-cisteina (2 mL), supplemento N2 (10 mL) e supplemento B27 (20 mL), sterilizzare il filtro con filtro da 0,22 μm. Dividere il supporto in aliquote da 25 ml in tubo conico da 50 ml e conservare a -80 °C. Supporto completo LWRN: combina supporti LWRN da 25 mL con 25 mL di supporti di base e integratore con fattore di crescita epidermico 200 ng/mL (EGF) (20μL) e 2 soluzione antibiotico-antimicotica (1 mL). Conservare il supporto completo a 4 °C. Collagene e Laminina: Sciogliere 5 mg di polvere in 5 mL di filtro sterilizzato 100 mM acido acetico (aggiungere 60 μL di brodo di acido acetico a 9,94 mL di acqua di grado molecolare) per produrre una concentrazione di stock di 1 mg/mL. Ruotare a 4 °C per 4 ore e creare aliquote da 100 μL in tubi da 0,2 ml. Congelare a -20 °C. La laminina viene acquistata ad una concentrazione di 100 μg/mL. Supporti completi senza fattori di crescita (CMGF-): Supplemento DMEM/F12 avanzato (500 mL) con 1x integratore di glutammina disponibile in commercio (5 mL), 10 mM HEPES (5 mL), 100 U/mL penicillina e, 100 g/mL streptomicina (5 mL). Mezzi di differenziazione: A 9,2 mL di supporti CMGF, aggiungere 200 μL di integratore B27, 100 μL di integratore N2, 20 μL di N-acetil-L-cisteina, 500 μL di media Noggin12 (fatto da cellule produttrici di Noggin) e 2 μL di EGF per fare 10 mL di mezzi di differenziazione. 2. Preparazione di lastre, vetrini da camera e inserti a membrana per coltura cellulare Rivestimento di vetrini a piastra e camera a 48 pozzi per placcatura monostrato 2D: utilizzare la soluzione di rivestimento che costituisce laminina (diluizione 1:40, vedi Tabella dei materiali)e collagene (diluizione 1:30) nella soluzione salina tamponata di fosfato di Dulbecco freddo, con Ca2 + e Mg2 + (DPBS). Aggiungere 200 μL di soluzione di rivestimento ad ogni pozzo e pre-incubare il vetrino piastra/camera in un incubatore di CO2 al 5% a 37 °C per almeno 2 ore. Rivestimento inserti di membrana di coltura cellulare da 0,4 μm: Effettuare la diluizione 1:30 del collagene in acqua di grado molecolare e aggiungere 200 μL ad ogni inserto. Mantenere la piastra contenente l’inserto a membrana sul ghiaccio a 4 °C per 30 minuti. Dopo 30 minuti di incubazione, tenere la piastra in un incubatore di CO2 al 5% a 37 °C per 1,5-2 ore. Gli inserti in poliestere e membrana in policarbonato danno risultati comparabili.NOTA: Qualsiasi piastra di coltura tissutale può essere seminata (è possibile eseguire la su e la downscaling) utilizzando questo protocollo regolando il volume collagene / laminina per ottenere una copertura completa della superficie di placcatura. 3. Isolamento della cripta NOTA: Prima di iniziare la dissezione, preparare inserti/vetrini rivestiti di collagene e/o laminina/scivolo a camera e lasciarli in un incubatore di CO2 al 5% a 37 °C. Preparare un banco di lavoro pulito e strumenti chirurgici sterili appropriati per la chirurgia e un armadietto di sicurezza biologico per la coltivazione di monostrati 2D. Confermare che tutte le altre apparecchiature standard per la coltura monostrato 2D come incubatore di CO2 umidificato, centrifughe da tavolo (mantenute a 4 °C), microscopio e pipette (comprese pipette sierologiche) sono pronte. Utilizzare topi C57Bl/6, di età 8-12 settimane. Eutanasia dei topi con un metodo approvato di eutanasia. Spruzzare le carcasse dei topi con soluzione di etanolo al 70% (EtOH) per pulire l’area di dissezione e rimuovere l’EtOH in eccesso utilizzando il tessuto di carta.NOTA: Assicurarsi che i reagenti di isolamento della cripta (come PBS, EDTA da 50 mM, shake buffer) siano mantenuti freddi. Questi reagenti possono essere preparati un giorno prima e sono buoni da usare per almeno 3 mesi se conservati a 4 °C. Inoltre, assicurarsi che il supporto completo LWRN sia conservato in un bagno di perline / acqua mantenuto a 37 °C fino all’uso. Usando forbici e forcende di dissezione pulite, sezionare il colon dal retto al cieco. Tenere l’estremità del colon con forcette e sciacquare molto delicatamente le feci utilizzando PBS ghiacciato in una siringa da 10 ml, dotata di un tubo di alimentazione da 20 G(Figura 1A). Assicurarsi di non rompersi i due punti. Rimuovere i due punti prossimali. Questa sarà la porzione del colon più vicina alla giunzione ileocecale. Con le forcep, far scorrere delicatamente il colon distale sul tubo di alimentazione da 20 G, legando il colon all’estremità del tubo dalla punta con filo di sutura di seta 4-0(Figura 1B). Invertire il colon verso l’interno con le dita sopra l’estremità legate e legare l’altra estremità con filo di sutura di seta 4-0. Utilizzando forbici chirurgiche, tagliare i due punti sotto la punta del tubo dialimentazione (Figura 1C,D,E). Utilizzando lo stantuffo di una siringa ripetuta da 1,25 ml, aprire delicatamente l’estremità slegata del colon invertito sulla punta di una siringa ripetuta da 1,25 ml. Far scorrere il colon rovesciato sull’estremità della siringa e legare saldamente con filo di sutura di seta 4-0 (Figura 1F, G). Inserire lo stantuffo nella siringa e gonfiare il colon per formare una salsiccia. Gonfiare fino a quando la salsiccia del colon sembra turgente senza rughe visibili (Figura 1H). Posizionare siringa/colon in un tubo da 15 ml con 5 ml di soluzione di recupero cellulare sul ghiaccio per 20 minuti, gonfiare e sgonfiare il colon una volta ogni 5 minuti(Figura 1I). La salsiccia deve rimanere gonfiata durante l’incubazione. Legare usando 4-0 filo di sutura di seta sotto la punta della siringa ripetuta con il colon gonfiato. Tagliare la salsiccia dalla siringa ripetuta e posizionare in un tubo da 15 ml contenente 10 ml di 50 mM (2mM per l’intestino tenue) EDTA per 40 minuti e ruotare a 4 °C(Figura 1J,K). Decantare la soluzione EDTA e sostituire con 5 mL di shake buffer. Agitare manualmente la salsiccia in posizione verticale (vigorosamente) per 2 min. Decantare la soluzione di scuotimento in un nuovo tubo da 15 ml e ripetere il passaggio di scuotimento per un totale di 10 ml di cripte nel tampone di scuotimento. Prendi 20 μL della sospensione della cripta in una piastra di Petri e conta il numero di cripte al microscopio. Calcola la concentrazione della cripta nelle cripte/μL. A seconda della concentrazione, diluire i campioni per ottenere 5 cripte/ μL al momento della placcatura (1000 cripte/cm2). Ruotare il tubo con cripte isolate utilizzando centrifuga da tavolo a 400 x g per 10 min a 4 °C. Nel frattempo, rimuovere la piastra/inserto/camera a 48 elementi dall’incubatore e posizionarla nell’armadio di biosicurezza. Aspirare la soluzione di rivestimento utilizzando P200 e lasciare la piastra con il coperchio leggermente sfalsato fino a quando le celle non sono pronte per essere placcate. 4. Coltivare monostrato 2D NOTA: Per un protocollo dettagliato su come generare monostrati epiteliali intestinali dai protocolli di controllo dei colonoidi 3D da parte dei laboratori Estes e Kovbasnjuk (7,11). Rimuovere il tampone di scuotimento utilizzando pipetta sierologica da 10 mL. Assicurarsi che il pellet sia intatto e che sia possibile utilizzare P1000 per rimuovere il liquido rimasto. Sospendere di nuovo il pellet in 3 mL di supporti completi LWRN e pipettare su e giù con P1000. Aggiungere 200 μL di cripte ad ogni pozzo di un vetrino/camera pre-rivestito da 48 porcile e incubare in un incubatore di CO2 al 5% a 37 °C. Il giorno seguente aspirare il supporto utilizzando P200 e aggiungere nuovi supporti. Le cellule diventano confluenti in 24-48 h. Per gli inserti a membrana di coltura cellulare, aggiungere 200 μL di cripte (5 cripte/μL) alla parte superiore degli inserti e 600 μL di supporti L-WRN completi nella parte inferiore. Il giorno seguente aspirare i supporti utilizzando P200 e aggiungere nuovi supporti solo alla camera superiore. Incubare la piastra in un incubatore di CO2 al 5% a 37 °C. La resistenza elettrica transepiteliale (TEER) viene misurata ogni giorno utilizzando il misuratore Epiteliale Volt/Ohm (EVOM).NOTA: se la cultura ha una lettura TEER maggiore di 300 Ω,cm2, sono pensati per essere confluenti. La confluenza si ottiene in 3-4 giorni. Cambia supporto ogni 2 giorni.