Génération de monocouches épithéliales primaires murines du côlon à partir de cryptes intestinales

Toutes les procédures décrites ci-dessous ont été approuvées et menées conformément aux lignes directrices établies par le Comité institutionnel de protection et d’utilisation des animaux de l’Université du Michigan. 1. Préparation de réactifs pour l’isolement et la culture en crypte (préparation dans la hotte de culture tissulaire) Acide tétraacétique éthylènediamine (EDTA) 50 mM : Ajouter 50 mL 0,5 M de stock à 450 mL de solution saline tamponnée au phosphate, sans calcium(Ca2+) et magnésium(Mg2+)pour préparer 500 mL. Dans ce protocole, pbs fera référence au PBS sans calcium et magnésium, sauf indication contraire. Tampon de secouage : Dissoudre 7,4 g de saccharose (43,3 mM) et 5 g de sorbitol (54,9 mM) dans du PBS pour préparer 500 mL. Milieu L-WRN (L-Wnt-3A, R-spondin et Noggin) : Supplément du produit Eagle Medium/Ham’s F-12 (DMEM/F12) d’Advanced Dulbecco (780 mL) avec 20 % de sérum fœtal bovin (FBS) (200 mL), 1x supplément de glutamine disponible dans le commerce (10 mL), pénicilline de 100 U/mL et 100 g/mL de streptomycine (10 mL), et stériliser le filtre avec un filtre de 0,22 μm. Obtenez des cellules L-WRN via ATCC, cultivez dans des flacons T175 et sélectionnez en utilisant Geneticin et Hygromycin. Les médias sont modifiés et collectés pendant 12 jours.REMARQUE: Chaque lot de supports est testé pour l’activité Wnt à l’aide d’un test TOPflash Wnt Reporter. Dans ce cas-ci les protocoles translationnels de laboratoire de modélisation de tissu de médecine de Michigan (https://www.umichttml.org/protocols) ont été suivis. La lignée cellulaire TOPflash HEK 293 est cultivée en confluence dans une fiole T75, trypsinisée et plaquée sur une plaque de 96 puits. Le lendemain, différentes dilutions du milieux collectés sont ajoutées aux cellules et incubées dans un incubateur à 5% deCO2 à 37 °C pendant la nuit. Le lendemain, les cellules sont lysées et le test de lucifly luciférase est effectué conformément aux instructions du fabricant. Le test est normalisé à l’aide de Wnt-3A recombinant. Le milieu est divisé en aliquotes de 25 mL dans des tubes coniques de 50 mL et se conserve à -80 °C. Milieu de base : Pour 500 mL, supplément Advanced DMEM/F12 (448 mL) avec 2x supplément de glutamine disponible dans le commerce (10 mL), HEPES 20 mM (10 mL), pénicilline 100 U/mL et 100 g/mL de streptomycine (10 mL), 2 mM de N-acétyl-L-cystéine (2 mL), supplément de N2 (10 mL) et supplément de B27 (20 mL), filtre stériliser avec un filtre de 0,22 μm. Diviser les milieux en aliquotes de 25 mL dans un tube conique de 50 mL et les conserver à -80 °C. Milieu complet LWRN : Combiner 25 mL de milieux LWRN avec 25 mL de milieu de base et compléter avec 200 ng/mL de facteur de croissance épidermique (EGF) (20 μL) et 2x solution antibiotique-antimycosique (1 mL). Conservez le support complet à 4 °C. Collagène et laminine : Dissoudre 5 mg de poudre dans 5 mL d’acide acétique stérilisé par filtre de 100 mM (ajouter 60 μL de stock d’acide acétique à 9,94 mL d’eau de qualité moléculaire) pour produire une concentration en stock de 1 mg/mL. Tourner à 4 °C pendant 4 h et faire des aliquotes de 100 μL dans des tubes de 0,2 mL. Congeler à -20 °C. La laminine est achetée à une concentration en stock de 100 μg/mL. Milieu complet sans facteurs de croissance (CMGF-) : Supplément avancé DMEM/F12 (500 mL) avec 1x supplément de glutamine disponible dans le commerce (5 mL), HEPES 10 mM (5 mL), pénicilline 100 U/mL et streptomycine 100 g/mL (5 mL). Milieu de différenciation : À 9,2 mL de milieu CMGF-, ajouter 200 μL de supplément de B27, 100 μL de supplément de N2, 20 μL de N-acétyl-L-cystéine, 500 μL de milieu de Noggin12 (fabriqué à partir de cellules productrices de Noggin) et 2 μL d’EGF pour faire 10 mL de milieux de différenciation. 2. Préparation de plaques, de lames de chambre et d’inserts de membrane de culture cellulaire Revêtement de plaques de 48 puits et de lames de chambre pour placage monocouches 2D: Utilisez la solution de revêtement qui constitue la laminine (dilution 1:40, voir table des matériaux)et le collagène (dilution 1:30) dans la solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco froide, avec Ca2 + et Mg2 + (DPBS). Ajouter 200 μL de solution de revêtement à chaque puits et pré-incuber la lame de la plaque/chambre dans un incubateur à 5 % deCO2 à 37 °C pendant au moins 2 h. Revêtement d’inserts de membrane de culture cellulaire de 0,4 μm : Faire une dilution 1:30 du collagène dans de l’eau de qualité moléculaire et ajouter 200 μL à chaque insert. Maintenir la plaque contenant l’insert membranaire sur de la glace à 4 °C pendant 30 min. Après 30 min d’incubation, conserver la plaque dans un incubateur à 5% deCO2 à 37 °C pendant 1,5-2 h. Les inserts à membrane en polyester et en polycarbonate donnent des résultats comparables.REMARQUE: N’importe quelle plaque de culture tissulaire peut être ensemencée (upscaling et downscaling peut être effectuée) en utilisant ce protocole en ajustant le volume de collagène / laminine pour obtenir une couverture complète de la surface de placage. 3. Isolation de la crypte REMARQUE: Avant de commencer la dissection, préparez le collagène et / ou laminine enduit de plaque / membrane inserts / lame lame et laissez-les dans un incubateur à 5% de CO2 à 37 ° C. Préparez un banc de travail propre et des instruments chirurgicaux stériles appropriés pour la chirurgie, ainsi qu’une armoire de sécurité biologique pour la culture de monocouches 2D. Confirmez que tous les autres équipements standard pour la culture monocouche 2D tels que l’incubateur de CO2 humidifié, les centrifugeuses de table (maintenues à 4 °C), les microscopes et les pipettes (y compris les pipettes sérologiques) sont prêts. Utilisez des souris C57Bl/6 âgées de 8 à 12 semaines. Euthanasier des souris à l’aide d’une méthode d’euthanasie approuvée. Vaporisez les carcasses de souris avec une solution d’éthanol à 70% (EtOH) pour nettoyer la zone de dissection et éliminer l’excès d’EtOH à l’aide de mouchoir en papier.REMARQUE: Assurez-vous que les réactifs d’isolation de crypte (tels que PBS, EDTA 50 mM, tampon de secousse) sont maintenus au froid. Ces réactifs peuvent être préparés un jour avant et peuvent être utilisés pendant au moins 3 mois lorsqu’ils sont conservés à 4 °C. Assurez-vous également que le support complet du LWRN est conservé dans un bain de perles ou d’eau maintenu à 37 °C jusqu’à son utilisation. À l’aide de ciseaux et de pinces de dissection propres, disséquer le côlon du rectum au caecum. Tenez l’extrémité du côlon à l’aide d’une pince et rincez très doucement les matières fécales à l’aide de PBS glacé dans une seringue de 10 mL, munie d’une sonde d’alimentation de 20 G(figure 1A). Assurez-vous de ne pas rompre le côlon. Enlever le côlon proximal. Il s’agira de la partie du côlon la plus proche de la jonction ileocecal. Avec une pince, faites glisser doucement le côlon distal sur la sonde d’alimentation de 20 G, en attachant le côlon à l’extrémité du tube par la pointe avec un fil de suture de soie 4-0(figure 1B). Inversez le côlon à l’envers à l’aide de ses doigts sur l’extrémité attachée et attachez l’autre extrémité avec un fil de suture de soie 4-0. À l’aide de ciseaux chirurgicaux, couper le côlon sous l’extrémité de la sonde d’alimentation (Figure 1C, D, E). À l’aide du piston d’une seringue de répétition de 1,25 mL, ouvrez doucement l’extrémité non déliée du côlon inversé sur l’extrémité d’une seringue de répétition de 1,25 mL. Faites glisser le côlon inversé sur l’extrémité de la seringue et attachez-le fermement avec un fil de suture de soie 4-0(figure 1F,G). Insérez le piston dans la seringue et gonflez le côlon pour former une saucisse. Gonfler jusqu’à ce que la saucisse du côlon semble turgente sans rides visibles( Figure 1H). Placer la seringue/le côlon dans un tube de 15 mL avec 5 mL de solution de récupération cellulaire sur de la glace pendant 20 min, gonfler et dégonfler le côlon une fois toutes les 5 minutes(figure 1I). La saucisse doit rester gonflée pendant l’incubation. Attachez à l’aide d’un fil de suture de soie 4-0 sous le bout de la seringue de répétition avec le côlon gonflé. Couper la saucisse de la seringue à répétition et placer dans un tube de 15 mL contenant 10 mL d’EDTA de 50 mM (2 mM pour l’intestin grêle) pendant 40 min et tourner à 4 °C(figure 1J,K). Décanter la solution d’EDTA et la remplacer par 5 mL de tampon de secousse. Agiter la saucisse manuellement en position verticale (vigoureusement) pendant 2 min. Décanter la solution de secousse dans un nouveau tube de 15 mL et répéter l’étape de secousse pour un total de 10 mL de cryptes dans un tampon de secousse. Prenez 20 μL de la suspension de la crypte dans une boîte de Petri et comptez le nombre de cryptes au microscope. Calculer la concentration de cryptes dans les cryptes/μL. En fonction de la concentration, diluer les échantillons pour obtenir 5cryptes/μL au moment du placage (1000 cryptes/cm2). Faire tourner le tube avec des cryptes isolées à l’aide d’une centrifugeuse de table à 400 x g pendant 10 min à 4 °C. En attendant, retirez la plaque/l’insert/lame de chambre de 48 puits de l’incubateur et placez-la dans une armoire de biosécurité. Aspirer la solution de revêtement à l’aide de P200 et laisser la plaque avec le couvercle légèrement décalé jusqu’à ce que les cellules soient prêtes à être plaquées. 4. Culture de la monocouche 2D REMARQUE: Pour un protocole détaillé sur la façon de générer des monocouches épithéliales intestinales à partir de coloïdes 3D, vérifiez les protocoles par les laboratoires Estes et Kovbasnjuk (7,11). Retirer la zone tampon de secousse à l’aide d’une pipette sérologique de 10 mL. Assurez-vous que le culot est intact et peut utiliser P1000 pour éliminer tout liquide restant. Re-suspendre la pastille dans 3 mL de milieu complet LWRN et pipetter de haut en bas avec P1000. Ajouter 200 μL de cryptes à chaque puits d’une plaque/chambre pré-revêtue de 48 puits et incuber dans un incubateur à 5 % de CO2 à 37 °C. Le lendemain, aspirez le média à l’aide du P200 et ajoutez de nouveaux médias. Les cellules deviennent confluentes en 24-48 h. Pour les inserts à membrane de culture cellulaire, ajouter 200 μL de cryptes (5 cryptes/μL) au-dessus des inserts et 600 μL de milieu L-WRN complet à la partie inférieure. Le lendemain, aspirez le média en utilisant le P200 et ajoutez des médias frais uniquement à la chambre supérieure. Incuber la plaque dans un incubateur à 5 % deCO2 à 37 °C. La résistance électrique transépithéliale (TEER) est mesurée tous les jours à l’aide d’un compteur de volts/ohm épithéliaux (EVOM).REMARQUE: Si la culture a une lecture TEER supérieure à 300 Ω,cm2,ils sont censés être confluents. La confluence est atteinte en 3-4 jours. Changez de média tous les 2 jours.