דור של מונוליירים אפיתל המעי הגס הראשי מורין מקריפטות מעיים

כל ההליכים המתוארים להלן אושרו ובוצעו בהתאם להנחיות שנקבעו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים ושימוש בבעלי חיים באוניברסיטת מישיגן. 1. הכנת ריאגנטים לבידוד ותרבות הקריפטה (היכונו למכסה המנוע של תרבות הרקמות) 50 מ”מ אתילנדיאמין חומצה טטראאצטית (EDTA): להוסיף 50 מ”ל 0.5 M מלאי ל 450 מ”ל של מלוחים מאגר פוספט, ללא סידן (Ca2+) ומגנזיום (מ”ג2 +) כדי להכין 500 מ”ל. בפרוטוקול זה PBS יתייחס PBS ללא סידן ומגנזיום אלא אם כן צוין אחרת. חיץ לנער: להמיס 7.4 גרם סוכרוז (43.3 מ”מ) ו 5 סורביטול גרם (54.9 מ”מ) ב PBS להכין 500 מ”ל. L-WRN (ל-וונט-3A, R-spondin ו Noggin) מדיה: תוספת מתקדמת של Dulbecco של הנשר שונה בינוני / Ham של F-12 (DMEM / F12) (780 מ”ל) עם 20% סרום שור עוברי (FBS) (200 מ”ל), 1x מסחרי זמין תוספת גלוטמין (10 מ”ל), 100 U/mL פניצילין ו, 100 גרם / מ”ל סטרפטומיצין (10 מ”ל), ומסנן לעקר עם מסנן 0.22 מיקרומטר. קבל תאי L-WRN דרך ATCC, לגדול צלושי T175, ובחר באמצעות גנטיקה והיגרומיצין. המדיה משתנה ונאספת במשך 12 יום.הערה: כל אצווה של מדיה נבדקת עבור פעילות Wnt באמצעות בדיקה של TOPflash Wnt Reporter. במקרה זה פרוטוקולי המעבדה למידול רקמות תרגום של הרפואה במישיגן (https://www.umichttml.org/protocols) בוצעו. קו התא TOPflash HEK 293 גדל למפגש בבקבוק T75, טריפסיני ומוצף על צלחת של 96 באר. למחרת דילולים שונים של המדיה שנאספה מתווספים לתאים ומדגירים באינקובטור CO2 5% ב 37 °C (69 °F) לילה. למחרת, התאים הם lysed, ו Firefly לוציפראז assay מבוצע על פי הוראות היצרן. ההסתעפות מנורמלת באמצעות Wnt-3A רקומביננטי. המדיה מחולקת 25 מ”ל aliquots בצינורות חרוט 50 מ”ל ולאחסן ב -80 מעלות צלזיוס. מדיה בסיסית: עבור 500 מ”ל, תוספת מתקדם DMEM/F12 (448 מ”ל) עם תוסף גלוטמין 2x זמין מסחרית (10 מ”ל), 20 מ”מ HEPES (10 מ”ל), 100 U/mL פניצילין ו, 100 גרם / מ”ל סטרפטומיצין (10 מ”ל), 2 מ”מ N-אצטיל-L-ציסטאין (2 מ”ל), תוספת N2 (10 מ”ל) ותוסף B27 (20 מ”ל), מסנן לעקר עם מסנן 0.22 מיקרומטר. לחלק את המדיה ל 25 aliquots מ”ל בצינור חרוט 50 מ”ל ולאחסן ב -80 מעלות צלזיוס. LWRN מדיה מלאה: לשלב 25 mL LWRN מדיה עם 25 מ”ל של מדיה בסיסית תוספת עם 200 ng/mL אפידרמיס גורם גדילה (EGF) (20μL) ו 2x פתרון אנטיביוטי אנטיביוטי (1 מ”ל). אחסן את המדיה המלאה ב- 4 °C (69 °F). קולגן ולמינין: להמיס 5 אבקת מ”ג ב 5 מ”ל של מסנן מעוקר 100 מ”מ חומצה אצטית (להוסיף 60 μL של מלאי חומצה אצטית ל 9.94 מ”ל של מים מולקולריים) כדי לייצר ריכוז מלאי של 1 מ”ג / מ”ל. לסובב ב 4 מעלות צלזיוס במשך 4 שעות ולעשות 100 μL aliquots בצינורות 0.2 מ”ל. להקפיא ב -20 מעלות צלזיוס. למין נרכש בריכוז מלאי של 100 מיקרוגרם / מ”ל. מדיה מלאה ללא גורמי גדילה (CMGF-): תוספת DMEM/F12 מתקדם (500 מ”ל) עם תוסף גלוטמין זמין מסחרית 1x (5 מ”ל), 10 מ”מ HEPES (5 מ”ל), 100 U/mL פניצילין, ו, 100 גרם / mL סטרפטומיצין (5 מ”ל). מדיה בידול: כדי 9.2 מ”ל של CMGF- מדיה, להוסיף 200 μL של תוספת B27, 100 μL של תוסף N2, 20 μL של N-אצטיל-L-ציסטאין, 500 μL של מדיה Noggin12 (עשוי תאים המייצרים Noggin) ו 2 μL של EGF כדי להפוך 10 מ”ל של מדיה בידול. 2. הכנת צלחות, שקופיות קאמריות ותוספות קרום תרבות התא ציפוי 48-באר צלחת שקופיות תא לציפוי מונולאייר 2D: השתמש בתמיסת הציפוי המהווה למין (1:40 דילול, ראה טבלה של חומרים)וקולגן (1:30 דילול) מלוחים אגירה פוספט של Dulbecco קר, עם Ca2 + ו Mg2 + (DPBS). הוסף 200 μL של פתרון ציפוי לכל באר מראש דגירה צלחת / שקופית תא ב 5% CO2 אינקובטור ב 37 °C (69 °F) לפחות 2 שעות. ציפוי 0.4 מיקרומטר תרבית תאים מוסיף: להפוך 1:30 דילול של קולגן במים כיתה מולקולרית ולהוסיף 200 μL לכל הכנס. שמור את הצלחת המכילה את הממברנה להוסיף על קרח ב 4 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות. לאחר 30 דקות דגירה, לשמור את הצלחת ב 5% CO2 אינקובטור ב 37 °C (69 °F) עבור 1.5-2 שעות. פוליאסטר וקרום פוליקרבונט מוסיף להניב תוצאות דומות.הערה: כל צלחת תרבית רקמה ניתן לזרוע (למעלה וצמצומים ניתן לבצע) באמצעות פרוטוקול זה על ידי התאמת נפח קולגן / למין כדי לקבל כיסוי מלא של משטח הציפוי. 3. בידוד קריפטה הערה: לפני תחילת הניתוח, להכין קולגן ו / או למין מצופה צלחת / ממברנה מוסיף / שקופית תא ולהשאיר אותם 5% CO2 אינקובטור ב 37 °C (69 °F). הכינו ספסל עבודה נקי ומכשירים כירורגיים סטריליים המתאימים לניתוח, וארון בטיחות ביולוגי לפולחן מונוליירים דו-מימדיים. אשרו את כל הציוד הסטנדרטי האחר עבור קולטי מונולייר דו-מימדיים כגון חממת CO2 לחה, צנטריפוגות שולחן (מתוחזקות ב-4 מעלות צלזיוס), מיקרוסקופ ופיפטות (כולל פיפטות סרולוגיות) מוכנות. השתמש C57Bl/6 עכברים, 8-12 שבועות. המתת חסד לעכברים בשיטה מאושרת של המתת חסד. לרסס את פגרים עכברים עם 70% אתנול (EtOH) פתרון לנקות את אזור הניתוח ולהסיר עודף EtOH באמצעות רקמת נייר.הערה: ודא כי ריאגנטים בידוד הקריפטה (כגון PBS, 50 mM EDTA, לחיץ לנער) קריפטות נשמרים קרים. ריאגנטים אלה יכולים להיות מוכנים יום אחד לפני והם טובים לשימוש לפחות 3 חודשים כאשר מאוחסנים ב 4 מעלות צלזיוס. כמו כן, ודא כי המדיה המלאה LWRN נשמר באמבט חרוזים / מים מתוחזק ב 37 מעלות צלזיוס עד השימוש. באמצעות מספריים ומלקחיים נקיים, לנתח את המעי הגס מפי הטבעת אל cecum. החזיקו את קצה המעי הגס בעזרת מלקחיים ושטפו בעדינות רבה את הצואה באמצעות PBS קר כקרח במזרק של 10 מ”ל, המצויד בצינור האכלה של 20 גרם(איור 1A). הקפד לא לקרוע את המעי הגס. הסר את המעי הגס הפרוקסימלי. זה יהיה החלק של המעי הגס הקרוב ביותר לצומת ileocecal. בעזרת מלקחיים, החליקו בעדינות את המעי הגס הדיסטלי אל צינור ההזנה של 20 G, וקשרו את המעי הגס בקצה הצינור בקצה חוט תפר משי 4-0(איור 1B). הפוך את המעי הגס מבפנים החוצה באמצעות אצבעותיו של אחד מעל הקצה קשור ולקשור את הקצה השני עם חוט תפר משי 4-0. בעזרת מספריים כירורגיות, חותכים את המעי הגס מתחת לקצה צינור ההזנה(איור 1C, D,E). באמצעות הכוען של מזרק חוזר 1.25 מ”ל, בעדינות לפתוח את הקצה הלא מאוית של המעי הגס הפוך על קצה של מזרק חוזר 1.25 מ”ל. החליקו את המעי הגס ההפוך לקצה המזרק וקשורו בחוזקה חוט תפר משי 4-0(איור 1F, G). הכנס את הוכנה לתוך המזרק ולנפח את המעי הגס כדי ליצור נקניק. לנפח עד נקניק המעי הגס נראה טורגנט ללא קמטים גלויים (איור 1H). מניחים מזרק /המעי הגס בצינור 15 מ”ל עם 5 מ”ל של פתרון שחזור תאים על קרח במשך 20 דקות, מנפחים ומנפחים את המעי הגס אחת ל-5 דקות(איור 1I). הנקניק חייב להישאר מנופח במהלך הדגירה. לקשור באמצעות חוט תפר משי 4-0 מתחת לקצה המזרק לחזור עם המעי הגס מנופח. חותכים את הנקניק את המזרק חוזר ומניחים בצינור 15 מ”ל המכיל 10 מ”ל של 50 מ”מ (2mM עבור המעי הדק) EDTA במשך 40 דקות ולסובב ב 4 מעלות צלזיוס(איור 1J,K). כבה את פתרון EDTA ולהחליף עם 5 מ”ל של חוצץ לנער. לנער את הנקניק באופן ידני במצב אנכי (במרץ) במשך 2 דקות. Decant את הפתרון רועד לתוך צינור חדש 15 מ”ל ולחזור על שלב רועד עבור סך של 10 מ”ל של קריפטות חיץ רועד. קח 20 μL של השעיית הקריפטה בצלחת פטרי ולספור את מספר הקריפטות תחת מיקרוסקופ. לחשב את ריכוז הקריפטה בקריפטות /μL. בהתאם לריכוז, לדלל את הדגימות כדי לקבל 5 קריפטות / μL ברגע של ציפוי (1000 קריפטות / ס”מ2). לסובב את הצינור עם קריפטות מבודדות באמצעות צנטריפוגה שולחן ב 400 x g במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. בינתיים, להסיר צלחת 48-באר / הכנס / שקופית תא מן האינקובטור ומניחים אותו בארון biosafety. לשאוף את פתרון הציפוי באמצעות P200 ולהשאיר את הצלחת עם המכסה מעט לקזז עד התאים מוכנים להיות מצופה. 4. קולטני 2D מונולייר הערה: לקבלת פרוטוקול מפורט על איך ליצור monolayers אפיתל מעיים מן המעי הגס 3D לבדוק פרוטוקולים על ידי אסטס מעבדות Kovbasnjuk (7,11). הסר את מאגר הרעידות באמצעות פיפטה סרולוגית של 10 מ”ל. ודא כי גלולה הוא שלם, ייתכן באמצעות P1000 כדי להסיר כל נוזל עזב. להשעות מחדש את גלולה ב 3 מ”ל של LWRN מדיה מלאה פיפטה למעלה ולמטה עם P1000. הוסף 200 μL של קריפטות לכל באר של צלחת מצופה מראש 48-טוב / שקופית קאמרית דגירה ב 5% CO2 חממה ב 37 °C (69 °F). למחרת לשאוף את המדיה באמצעות P200 ולהוסיף מדיה חדשה. התאים הופכים להיות משולבים ב 24-48 שעות. עבור מוסיף קרום תרבות התא, להוסיף 200 μL crypts (5 קריפטות / μL) לראש מוסיף ו 600 μL של מדיה מלאה L-WRN לחלק התחתון. למחרת לשאוף את התקשורת באמצעות P200 ולהוסיף מדיה טרייה רק לתא העליון. דגירה את הצלחת ב 5% CO2 אינקובטור ב 37 °C (69 °F). התנגדות חשמלית Transepithelial (TEER) נמדדת מדי יום באמצעות מד וולט אפיתל / אוהם (EVOM).הערה: אם לתרבות יש קריאת TEER הגדולה מ- 300 Ω.cm2, הם אמורים להיות משולבים. קונפלונציה מושגת ב 3-4 ימים. שנה מדיה כל יומיים.