Un modello murino di ommaya xenotrapianto per studiare la terapia mirata diretta della malattia leptomeningea

Il protocollo è stato approvato dal Comitato istituzionale per la cura e l’uso degli animali della University of South Florida (IS00005974). 1. Iniezione di CTC in CSF per generare un modello LMD murino Preparazione dei CTC Calcolare il numero di CTC necessari per l’iniezione e preparare una sospensione unicellulare a 1,0 ×10 4 cellule / μL in soluzione salina sterile tamponata con fosfato (PBS). Posizionare la sospensione cellulare su ghiaccio o a 4 °C durante tutta la procedura.NOTA: quando si utilizzano linee cellulari che richiedono tripsinizzazione, assicurarsi di lavare le cellule due volte con PBS sterile per rimuovere la tripsina. Eseguire il conteggio delle cellule utilizzando un emocitometro o un contatore di celle automatizzato. Se viene utilizzata una coorte di grandi dimensioni (>50 topi), riconteggi le cellule e convalida la vitalità cellulare tra le iniezioni per garantire che venga somministrato un numero coerente di cellule per topo. Procedura prechirurgica Inietti il topo per via sottocutanea con 1 mg/kg di buprenorfina a rilascio prolungato (Bup-SR).NOTA: Non iniettare l’area dell’incisione proposta; scegliere un sito di iniezione ben lontano dalla scapola. Anestetizzare il mouse con il 2-3% di isoflurano fino a quando non mostra segni del riflesso di raddrizzamento. Inoltre, controllare il riflesso del pizzico della coda e / o della zampa per confermare lo stato di anestesia. Preparare il mouse per l’intervento chirurgico in un luogo lontano dall’area operatoria. Tagliare il sito chirurgico (cioè la superficie dorsale del cranio) con un’area di confine sufficiente per evitare che la pelliccia contamini il sito di incisione; quindi, saturare il sito con antisettico della pelle germicida, lavorando dal centro del sito alla periferia, quindi lasciare asciugare. Applicare un drappo sterile o un telo di plastica sterile con supporto adesivo per proteggere il sito chirurgico dalla contaminazione.NOTA: gli strumenti devono essere autoclavati in anticipo e le punte risterizzate tra gli animali utilizzando uno sterilizzatore per perle di vetro. Radere la pelliccia dell’intera superficie ventrale della testa e preparare la pelle usando la tecnica sterile. Situare il naso con un cono nasale a forma di L modificato dell’apparato stereotassico, assicurando che le narici rimangano chiare e aperte. Usando del nastro adesivo sulle superfici ventrali di entrambe le penne, tirare delicatamente la pelle in avanti per fissarla al cono del naso e piegare il collo con un angolo di circa 90 ° una volta fissato. Somministrare l’1,5% di isoflurano per mantenere l’anestesia.NOTA: Il corretto posizionamento comporterà la presentazione dell’area dell’incisione in modo da consentire la facile identificazione della cresta caudale dell’osso occipitale. Posizionare il corpo per garantire che la colonna vertebrale sia mantenuta a livello con la cisterna magna e, mentre si applica una leggera trazione alla coda, posizionare del nastro adesivo alla base della coda per fissarlo. Iniezione chirurgica di cisterna magna Con il collo in piena estensione, e iniziando proprio tra le penne, eseguire le punte chirurgiche a forbice verso il basso con una leggera pressione attraverso l’osso occipitale.NOTA: Mentre si è in questa posizione della linea mediana, una piccola depressione è evidente quando le punte delle forbici si ispirano nell’area concava sopra la cisterna magna. Fai una piccola incisione della linea mediana di 3-5 mm appena sopra la concavità palpata. Aspirare 5 μL di sospensione cellulare a 1,0 ×10 4 celle/μL (totale 5,0 ×10 4 cellule) in una siringa Hamilton da 30 G. Utilizzare pinca a punta smussata con punte da 1-2 mm per premere delicatamente sulla cisterna magna. Introdurre le punte in posizione chiusa e aprirle mentre si applica una pressione verso il basso sulla dura. Ripetere la dissezione smussata descritta nel passaggio precedente fino a quando la membrana durale è facilmente identificabile e i vasi sanguigni associati sono visibili nell’area esposta.NOTA: La finestra di iniezione risultante assicura che i vasi sanguigni non siano danneggiati durante l’inserimento dell’ago. Tenendo la pinna aperta per ritrarre la muscolatura circostante, introdurre un ago non carotaggio da 30 G sotto la dura per visualizzare la smussatura. Assicurarsi che l’ago sia introdotto solo appena oltre la smussatura stessa. Distribuire lentamente uno stantuffo a siringa e consegnare le celle appena sotto la dura. Posizionare correttamente la smussatura per osservare l’iniezione sotto la dura. Somministrare con attenzione la tecnica e utilizzare l’ago non carotaggio da 30 G per evitare danni alla membrana e garantire perdite minime. Se si nota una perdita, applicare una leggera pressione con un applicatore con punta di cotone. Chiudere la pelle applicando una clip per ferite o una micro-goccia di adesivo per la pelle. Una volta eseguita con successo l’iniezione, consentire ai topi di riprendersi dall’anestesia su una coperta calda, osservandoli continuamente fino a quando non possono mantenere la posizione sternale e dimostrare un movimento pronostico. Monitorare i topi ogni giorno dopo l’intervento chirurgico per la prima settimana. Se un topo sembra essere in difficoltà o dolore, trattarlo con 10 mg / kg di iniezione sottocutanea di carprofene una volta ogni 12-24 ore per un massimo di 5 giorni in base alla consultazione veterinaria e alla direttiva. Consentire ai topi di recuperarli e monitorarli per almeno 48-72 ore prima di procedere al passaggio successivo.NOTA: Bup-SR, somministrato preventivamente, durerà fino a 72 ore, quindi normalmente non sono necessari analgesici aggiuntivi. Tuttavia, agli animali verrà fornito un analgesico aggiuntivo se necessario (se letargico, non mangiando, arruffato). Se un sito chirurgico sviluppa segni di infezione postoperatoria (cioè arrossamento, gonfiore, tenerezza, allodinia, iperalgesia, iperpatia o suppurazione), o se il topo sta proteggendo l’area interessata, eutanasia il topo. Se le cellule tumorali vengono iniettate con successo nel CSF, LMD e la progressione tumorale si svilupperanno nel SNC entro 1 o 2 settimane (a seconda dei tipi di CTC o della linea cellulare utilizzata) (Figura 1). 2. Assemblaggio e impianto murino Ommaya Preparazione della stazione Disinfettare la superficie della stazione. Posizionare una copertura blu sulla superficie e tenere pronti tutti gli strumenti e le forniture sterilizzate indicati nella Figura 2. Procedura prechirurgica Applicare analgesia (Bup-SR) e mantenere la tecnica sterile come descritto al paragrafo 1.2. Impianto chirurgico di Murine Ommaya Assemblare il dispositivo di iniezione Murine Ommaya utilizzando una porta di iniezione miniatura da 25 G (0,51 mm di diametro esterno) e un disco distanziatore da 1 mm. Utilizzare un adesivo sterile cianoacrilato per garantire la penetrazione di circa 2,5 mm della cannula metallica nell’emisfero cerebrale destro (Figura 3A-C).NOTA: Un prototipo di Mouse Ommaya compatibile con la risonanza magnetica è stato sviluppato in questo laboratorio, che ha già entrambe le parti (porta di iniezione in miniatura e distanziatore) stampate in 3D insieme come una singola unità(Figura 3D). La versione a singola unità è stata testata mediante risonanza magnetica e può far risparmiare tempo eliminando la fase di assemblaggio. Anestetizzare il mouse con il 2-3% di isoflurano fino a quando non ci sono segni del riflesso di raddrizzamento. Inoltre, controllare il riflesso del pizzico della coda e / o della zampa per confermare lo stato di anestesia. Radere l’intera superficie ventrale della testa di pelliccia e preparare la pelle secondo la tecnica sterile, come precedentemente descritto al punto 1.2.3. Posizionare il topo nell’apparato stereotassico con un cono nasale per continuare la somministrazione di isoflurano durante la procedura; diminuire l’isoflurano all’1,5%. Stringere delicatamente le barre auricolari per fissare la testa e applicare lubrificante per gli occhi per coprire gli occhi del mouse. Fare una piccola incisione cutanea (3 mm), seguita da una dissezione smussata dei tessuti sottocutanei sottostanti per esporre il cranio. Asciugare il cranio usando bastoncini applicatori con punta di cotone imbevuti di perossido di idrogeno. Praticare un foro di bava nel cranio posteriore di 0,5 mm e laterale di 1,1 mm del bregma – il punto anatomico sul cranio in cui la sutura coronale è intersecata perpendicolarmente dalla sutura sagittale (Figura 3A) – così come un foro di sbavatura di 0,9 mm per esporre la dura madre. Spostare il microdrill da parte e segnare delicatamente l’osso immediatamente circostante il foro della bava prima di inserire una porta di iniezione (profondità di circa 2,5 mm), fissata al cranio utilizzando un adesivo sterile cianoacrilato. Sutura di stato attorno al punto di iniezione utilizzando 4-0 suture di nylon senza assorbimento in un modello di punto interrotto o sutura di corda della borsa11. Casa topi post-chirurgici in gabbie individuali per il recupero chirurgico.NOTA: È possibile che l’Ommaya murino possa staccarsi quando più topi recuperati dall’intervento chirurgico sono alloggiati nella stessa gabbia, probabilmente a causa di costanti interazioni di manomissione. Si raccomanda che i topi impiantati da Murine Ommaya siano alloggiati individualmente (o non più di 2 topi per gabbia) nel corso dello studio sull’efficacia del farmaco. 3. Trattamento Murine Ommaya Dosaggio di topi con Murine Ommaya Anestetizzare il mouse con il 2-3% di isoflurano, fino a quando non ci sono segni di riflesso raddrizzamento. Inoltre, controllare il riflesso del pizzico della coda e / o della zampa per confermare il mantenimento dell’anestesia. Accedere a Murine Ommaya utilizzando un adattatore per iniezione della porta e una siringa Hamilton. Utilizzando la pinna, tenere la parte superiore della porta di iniezione in miniatura e inserire delicatamente l’adattatore dell’iniettore della porta completamente nel setto della porta.NOTA: l’iniettore della porta perfora il setto della porta in modo da ridurre al minimo lo spazio morto e consentire l’iniezione controllata tramite una pompa a siringa motorizzata (Figura 4A). I trattamenti mirati/nuovi vengono iniettati ad una portata di 1 μL/min durante l’anestesia. Il trattamento deve essere somministrato a intervalli specificati (giornaliero / settimanale) per una durata prestabilita (settimane / mesi), a discrezione del ricercatore.Un volume compreso tra 3 e 7 μL è ottimale, poiché un volume 7 μL può causare troppa pressione. La dimensione della siringa Hamilton può variare da 10 a 100 μL, a seconda del numero di topi in ciascun braccio di trattamento. Il precaricamento del volume appropriato nella siringa Hamilton impedirà la sostituzione ripetuta della siringa, riducendo così al minimo gli errori. È meglio dedicare 1 siringa Hamilton per braccio di trattamento. Una volta effettuata l’iniezione, staccare Murine Ommaya dall’adattatore per iniezione della porta usando una pinza e riportare il topo nella gabbia per riprendersi dall’anestesia, come descritto sopra nel passaggio 1.3.7. Eutanasia Eutanasia dei topi per inalazione di anidride carbonica (CO2)da una fonte di serbatoio compresso. Esporre i topi a concentrazioni crescenti di CO2 (cioè, deve essere utilizzato un tasso di spostamento dal 10% al 30% del volume / min della camera) per evitare o ridurre al minimo il disagio o l’angoscia. Monitorare i topi fino alla garanzia di cessazione dei movimenti cardiovascolari e respiratori.