レプトメニンゲレス病の直接標的療法を研究するマウス・オンマヤ異種移植片モデル

この議定書は、南フロリダ大学の制度的動物の世話と使用委員会(IS00005974)によって承認されました。 1. CSF への CTC の注入によるマウス LMD モデルの生成 CTCの準備 注射に必要なCTCの数を計算し、1.0×104 細胞/μLの無菌リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で単細胞懸濁液を調製します。細胞懸濁液を氷の上または4°Cの手順全体で置きます。注:トリプシン化が必要な細胞株を使用する場合は、トリプシンを除去するために滅菌PBSで細胞を2回洗浄してください。ヘモサイトメーターまたは自動セルカウンターを使用して細胞数を計算します。大きなコホート(>50マウス)を使用する場合は、細胞を再集計し、注射の間の細胞生存率を検証して、マウスごとに一貫した数の細胞が投与されるようにします。 前外科手術 マウスを皮下に1mg/kgブプレノルフィン持続放出(Bup-SR)で注入する。注:提案された切開の領域を注入しないでください。十分に肩甲骨から離れた注射部位を選択してください。 マウスを2~3%のイソフルランで麻酔し、右反射の兆候が見えなくなるまで麻酔をします。また、尾や足のピンチ反射を確認して麻酔の状態を確認します。 手術領域から離れた場所で手術のためにマウスを準備します。切開部位を汚染する毛皮を防ぐのに十分な境界領域を有する外科部位(すなわち、頭蓋骨の後ろ面)をクリップする。次に、殺菌性皮膚消毒剤でサイトを飽和し、サイトの中心から周辺まで働き、乾燥させます。滅菌ドレープまたは滅菌接着剤で裏打ちされたプラスチックドレープ材料を塗布して、外科現場を汚染から保護します。注:器具は事前にオートクレーブされ、先端はガラスビーズの殺菌器を使用して動物間で再殺菌されるべきである。 頭部の腹側表面全体の毛皮を剃り、滅菌技術を用いて皮膚を準備する。 立体戦術装置の改変されたL字型の鼻コーンで鼻を設置し、ナレスが透明で開いたままであることを確認します。両ピネの腹側表面にテープを使用して、皮膚を優しく前方に引っ張って鼻コーンに固定し、一度固定したら約90°の角度で首を曲げます。麻酔を維持するために1.5%のイソファランを投与する。注:適切な位置決めは、後頭部骨の尾根の容易な識別を可能にする方法で切開領域が提示される結果となる。 背骨が水槽マグナと同じレベルに保たれるように体を配置し、尾部にわずかなトラクションを施しながら、テールベースにテープを置いて固定します。 外科用水槽マグナ注射 首を完全に伸ばして、ピネの間から始まり、後頭部の骨を横切ってわずかな圧力で外科的はさみの先端を下方に走らします。注:この正中の位置にいる間、シスターナマグナの上の凹部にはさみの先端が浸ると、小さなくぼみが目立ちます。 触診した凹部のすぐ上に小さな3〜5mmの正中線切開を行います。1.0 × 10個の 4 細胞/μL (合計 5.0 × 104 細胞) で 5 μL の細胞懸濁液を 30 G ハミルトンシリンジに引き込みます。 1-2 mmの先端を持つ鈍い先端の鉗子を使用して、水槽のマグナを静かに押し下げます。閉じた位置にチップを導入し、硬膜に下圧を加えながら開きます。 硬膜が容易に同定されるまで前のステップで説明した鈍い解剖を繰り返し、そして、関連する血管が露出領域に見える。注:結果として得られる注入の窓は針の挿入の間に血管が損傷を受けなくなっている保障する。 鉗子を開いたまま周囲の筋肉を引き込む間、ベベルを視覚化するために硬膜の下に30Gの非得点針を導入する。針がベベル自体を超えて導入されていることを確認します。ゆっくりと注射器プランジャーを展開し、硬膜のすぐ下に細胞を送達します。 ベベルを適切に配置して、硬膜の下に注射を観察します。慎重に技術を管理し、膜への損傷を防ぎ、最小限の漏出を確保するために30 Gの非採点針を使用します。漏れが指摘された場合は、綿の先端のアプリケーターで穏やかな圧力を加えます。 傷ついたクリップまたは皮膚接着剤のマイクロドロップを塗布して、皮膚を閉じます。注射が正常に行われたら、マウスは暖かい毛布の麻酔から回復し、胸骨の位置を維持し、意図的な動きを実証できるようになるまで継続的に観察することができます。 最初の週の手術後、毎日マウスを監視します。マウスが痛みや苦痛を感じているようであれば、12~24時間に1回、12~24時間に1回、獣医の相談と指示に基づいてカルプロフェンを10mg/kgの皮下注射で治療してください。マウスが回復し、次のステップに進む前に、少なくとも48〜72時間監視できるようにします。注意:Bup-SRは、プリエンプティブに与えられ、最大72時間持続するので、追加の鎮痛薬は通常必要ありません。しかし、動物は必要に応じて追加の鎮痛薬を提供されます(無気力、食べない、フリルの場合)。手術部位が術後感染の兆候(すなわち、発赤、腫脹、圧痛、痛み、痛み、痛み、または膿瘍)を発症した場合、またはマウスが患部を守っている場合、マウスを安楽死させる。がん細胞がCSFに正常に注入された場合、LMDおよび腫瘍の進行は1〜2週間以内にCNSで発症する(使用されるCTまたは細胞株の種類に応じて) (図1)。 2. ネズミオンマヤアセンブリと移植 駅の準備 ステーション表面を消毒します。青い被覆を表面に置き、 図2に示されているすべての滅菌工具と消耗品を準備してください。 前外科手術 鎮痛(Bup-SR)を適用し、セクション1.2で説明したように滅菌技術を維持する。 ネズミのオンマヤの外科的移植 25 G (0.51 mm の外径) のミニチュア射出口と 1 mm のスペーサー ディスクを使用して、マウス オンマヤインジェクション デバイスを組み立てます。シアノクリレート滅菌接着剤を使用して、右脳半球への約2.5mmの金属カニューレの浸透を確実にする(図3A-C)。注:MRI互換マウスOmmayaプロトタイプは、すでに両方の部品(ミニチュアインジェクションポートとスペーサ)を1つのユニットとして一緒に3Dプリントしたこの研究室で開発されました(図3D)。単一ユニットバージョンはMRIによってテストされ、組み立てステップを排除することで時間を節約できます。 右反射の兆候がなくなるまで、2-3%イソフルランでマウスを麻酔します。また、麻酔の状態を確認するために、尾や足のピンチ反射を確認してください。 ファーの頭の腹側表面全体を剃り、手順1.2.3で前述したように、滅菌技術に従って皮膚を準備する。マウスを鼻コーンで立体化装置に入れ、処置中にイオブルラン投与を継続する。イオブルランを1.5%に減らす。耳の棒を軽く締めて頭を固定し、目の潤滑剤を塗布してマウスの目を覆います。 小さな皮膚切開(3mm)を行い、続いて下層の皮下組織を鈍い解剖して頭蓋骨を露出させる。過酸化水素浸し綿チップアプリケータースティックを使用して頭蓋骨を乾燥させます。 頭蓋骨に0.5mm後部および1.1mmの針状縫合糸が矢状縫合糸によって垂直に交差する頭蓋骨の矢状の解剖学的点の1.1mm側面にバリ穴を開け、0.9mmのバリ穴を開けて硬膜を露出させる。マイクロドリルを脇に移動し、注射口(約2.5mmの深さ)を挿入する前に、バリ穴を取り囲む骨を優しくスコアリングし、シアノアクリル酸滅菌接着剤を使用して頭蓋骨に貼り付けます。中断されたステッチパターンまたは財布の紐縫合線11に4-0ノー吸光度ナイロン縫合糸を使用して射出スポットの周りの状態縫合。 手術後のマウスを個々のケージに入れて、手術の回復を行う。注:複数の手術で回復したマウスが同じケージに収容されている場合、マウスオンマヤが外れる可能性があります。マウス・オンマヤ移植マウスは、薬物有効性試験の過程で個別に(またはケージあたり2匹以下のマウス)収容することが推奨される。 3. ネズミオンマヤ治療 マウス・オンマヤを使用したマウスのドージング 反射を右にする兆候がなくなるまで、2-3%のイソフルランでマウスを麻酔します。また、尾や足のピンチ反射を確認して麻酔の維持を確認します。 ポートインジェクションアダプターとハミルトン注射器を使用して、マウス・オンマヤにアクセスします。鉗子を使用して、ミニチュア注入口の上部を保持し、ポートインジェクターアダプターをポートの中隔に完全に静かに挿入します。注:ポートインジェクタは、デッドスペースを最小限に抑え、電動シリンジポンプを介して制御された注入を可能にする方法でポートの中隔を貫通します(図4A)。麻酔下で、標的/新規治療を1 μL/minの流量で注入します。治療は、研究者の裁量に従って、一定の期間(数週間/月)、指定された間隔(毎日/毎週)で与えられる予定です。3 μL から 7 μL までのボリュームは、3 μL のボリュームが圧力を大きくする可能性があるため、最適です。ハミルトンシリンジのサイズは、各治療アームのマウスの数に応じて、10〜100 μLの範囲で可能です。適切なボリュームをハミルトンのシリンジにプリロードすることで、シリンジの繰り返し交換が防止され、エラーを最小限に抑えることができます。治療アームごとに1ハミルトンシリンジを捧げるのが最善です。 注射が行われたら、鉗子を使用してポートインジェクションアダプターからマウス・オンマヤを取り外し、ステップ1.3.7で前述したように、マウスをケージに戻して麻酔から回復します。 安楽死 圧縮タンク源から二酸化炭素(CO2)を吸入してマウスを安楽死させる。マウスをCO2 の濃度を増加させる(すなわち、チャンバー体積/分の10%から30%の変位率が使用される)に当てはめるため、不快感や苦痛を回避または最小限に抑えます。心血管および呼吸運動の停止の保証までマウスを監視します。