Hier beschreiben wir ein murines Xenograft-Modell, das funktionell einem Ommaya-Reservoir bei Patienten ähnelt. Wir haben die Murine Ommaya entwickelt, um neuartige Therapeutika für die universell tödliche Leptomeningealerkrankung zu untersuchen.
Die Leptomeningealerkrankung (LMD) ist eine seltene Art von Metastasen des zentralen Nervensystems (ZNS) in der zerebralen Rückenmarksflüssigkeit (CSF). Die häufigsten Krebsarten, die LMD verursachen, sind Brust- und Lungenkrebs und Melanom. Patienten, bei denen LMD diagnostiziert wurde, haben eine sehr schlechte Prognose und überleben in der Regel nur wenige Wochen oder Monate. Ein möglicher Grund für die mangelnde Wirksamkeit der systemischen Therapie gegen LMD ist das Versagen, therapeutisch wirksame Wirkstoffkonzentrationen im Liquor aufgrund einer intakten und relativ undurchlässigen Blut-Hirn-Schranke (BBB) oder Blut-Liquor-Schranke über den Aderhautplexus zu erreichen. Daher kann die direkte Intrathekal- oder Intraventrikel-Verabreichung von Medikamenten diese Barrieren überwinden. Diese Gruppe hat ein Modell entwickelt, das die effektive Verabreichung von Therapeutika (d. H. Medikamente, Antikörper und Zelltherapien) chronisch und die wiederholte Probenahme von Liquor ermöglicht, um Arzneimittelkonzentrationen und Zielmodulation im Liquor zu bestimmen (wenn die Tumormikroumgebung bei Mäusen anvisiert wird). Das Modell ist das murine Äquivalent eines magnetresonanztomographiekompatiblen Ommaya-Reservoirs, das klinisch eingesetzt wird. Dieses Modell, das am Schädel befestigt ist, wurde als “Murine Ommaya” bezeichnet. Als therapeutischer Proof of Concept wurden Humane epidermale Wachstumsfaktorrezeptor-2-Antikörper (Klon 7.16.4) über die Murine Ommaya in den Liquor abgegeben, um Mäuse mit LMD aus humanem epidermalem Wachstumsfaktorrezeptor 2-positivem Brustkrebs zu behandeln. Die Murine Ommaya erhöht die Effizienz der Medikamentenabgabe mit einem Miniatur-Zugangsport und verhindert die Verschwendung von überschüssigen Medikamenten; es stört nicht die Liquorprobenahme für molekulare und immunologische Studien. Die Murine Ommaya ist nützlich, um neuartige Therapeutika in experimentellen LmD-Modellen zu testen.
Die Leptomeningealkrankheit (LMD) ist eine aggressive Metastasierung des ZNS im Spätstadium, bei der Tumorzellen auf den Liquor zugreifen und die Oberfläche des Gehirns und des Rückenmarks infiltrieren1. Zu den häufigsten Krebsarten, die LMD verursachen, gehören die der Brust und Lunge sowie das Melanom2. LMD führt zu einer Reihe von neurologischen Symptomen und Anzeichen wie Kopfschmerzen, Hirnnervenlähmungen, steifem Nacken und Radikulopathien. Die Prognose für Patienten mit LMD ist im Allgemeinen sehr schlecht (durchschnittliches Überleben wird in Wochen gemessen) und ist universell tödlich3,4,5,6,7. Die Behandlung mit Operation, Bestrahlung und systemischer Chemotherapie ist palliativ. Die systemische Therapie für LMD kann aufgrund einer unzureichenden Penetration des Arzneimittels in den Liquor über eine intakte BBB- oder Blut-LIQUOR-Barriere über den Aderhautplexus1fehlschlagen.
Daher kann die Verabreichung von Krebstherapeutika (z. B. Medikamente und Antikörper-basierte Behandlungen einschließlich Checkpoint-Inhibitoren und Zelltherapien) direkt in den Liquor diese Einschränkung überwinden8. Der Zugang und die Probenahme von Liquor von Patienten ist über ein Ommaya-Reservoir möglich, das unter die Kopfhaut implantiert wird. Dieses Gerät ermöglicht die Verabreichung von Krebsmitteln (z. B. Methotrexat und Trastuzumab) sowie die Probenahme von Liquor für diagnostische Studien (z. B. die zytologische Diagnose von LMD zur Überwachung auf Das Ansprechen auf die Behandlung), ohne eine Wirbelsäulentippentapsung durchzuführen. Ein murines Ommaya-Reservoir wurde entwickelt, um die klinisch verwendeten nachzuahmen. Das Reservoir erfordert die Montage eines Zugangsanschlusses und Abstandshalterteile sowie eine Modifikation der Mauskannulationstechnik, die es dem Gerät ermöglicht, während der gesamten Dauer der Arzneimittelstudie dauerhaft intakt zu bleiben. Dieses Gerät wurde als “Murine Ommaya” bezeichnet.
Im Gegensatz zur osmotischen Infusionspumpentechnik, die die Vorbereitung überschüssiger Flüssigkeitsvolumina erfordert, um den leeren Raum im Schlauch und die kontinuierliche Infusion über häufige Injektionen9vorzufüllen, minimiert die Murine Ommaya die Verschwendung von Arzneimittellösungen. Es ermöglicht die effektive Verabreichung mehrerer Einzeldosen von Behandlungen zu einem bestimmten Zeitpunkt in kleinen Mengen (3-7 μL) in den Liquor mit einer Hamilton-Spritze, einem Miniatur-Zugangsport und einem automatischen Injektor. In Echtzeit kann die Wirksamkeit von Testmedikamenten gegen LMD durch Bildgebung bestimmt werden. Mit diesem Ansatz kann eine Vielzahl von Chemotherapien, Antikörpern und Zellimmuntherapien (als Einzel- oder Kombinationsmittel) gegen LMD getestet werden, um In-vivo-Ergebnisse in rationale Behandlungsstrategien für Patienten umzusetzen. Um die Bildgebungskapazität für ein patientenabgeleitetes Xenograft(PDX)-Modell von LMD weiter zu verbessern, wurde eine Zusammenarbeit mit einem Hersteller unternommen, um eine Magnetresonanztomographie (MRT)-kompatible Version des Murine Ommaya zu entwickeln, die keine Montage erfordert und einsatzbereit ist. Die MRT-Fähigkeit ist von Vorteil, insbesondere für PDX-Modelle, bei denen die Menge der zirkulierenden Tumorzellen (CTCs) aus csF manchmal der limitierende Faktor ist, und oft, wenn die Vormarkierung von CTCs nicht durchführbar ist.
Dieses Papier beschreibt ein detailliertes Protokoll, das mit der Injektion von CTCs beginnt, um Mäuse mit LMD zu rendern. Die Murine Ommaya wird dann chirurgisch implantiert und mehrere medikamentöse Behandlungsschritte über die Murine Ommaya werden durchgeführt. Als Proof of Concept zur Demonstration wurde ein In-vivo-Side-by-Side-Vergleich durchgeführt, bei dem der murine humane epidermale Wachstumsfaktorrezeptor 2 (Her2)-Antikörper namens Klon 7.16.4 (das menschliche Äquivalent von Trastuzumab)10abgegeben wurde. Der Antikörper zielt entweder über die Murine Ommaya (direkt- oder intrathekale Therapie) oder durch intraperitoneale Injektion (systemische Therapie) auf Her2+ Brustkrebszellen ab. Die Ergebnisse zeigten, dass Mäuse mit LMD, die eine direkte intrathekale Immuntherapie erhielten, signifikant länger lebten als diejenigen, die systemisch mit derselben Therapie behandelt wurden. Die ZNS-Metastasen bei Mäusen, die über die Murine Ommaya behandelt wurden, wurden durch die dritte Dosis der dritten Behandlungswoche fast vollständig regressiert, was zu einem verbesserten Gesamtüberleben führte.
Hier wurde die Murine Ommaya als zuverlässiges Modell beschrieben, das eine wiederholte Verabreichung von Krebsmedikamenten in den Liquorraum in präklinischen Modellen von LMD und anderen ZNS-bedingten Erkrankungen ermöglicht. CSF wurde von Mäusen entnommen, während das Gerät noch ohne Unterbrechung angebracht war. Dieses direkt zielgerichtete Xenograft-Modell ist ein wichtiger Schritt bei der Entwicklung und Erprobung rationaler Behandlungsstrategien für LMD. Die Zeit von der Injektion von Cisterna Magna bis zum ersten Anzeichen der LMD-Entwicklung variiert je nach Krebszelltyp. LMD- und ZNS-Metastasen beginnen etwa 1 oder 2 Wochen nach der CTC-Impfung ihre Form anzunehmen. Wenn eine stark proliferative Krebszelllinie verwendet wird, ist es möglich, dass Metastasen in <7 Tagen auftreten können. In diesem Fall kann eine Vaskularisierung aufgrund von Tumorwachstum die Implantation der Murine Ommaya manchmal schwierig machen. Eine Lösung für diese Herausforderung besteht darin, die Anzahl der Krebszellen für die Injektion in den Liquorraum zu reduzieren, um mehr Zeit vor der Tumorentwicklung zu haben. Darüber hinaus wurde dieses Protokoll optimiert, um die Murine Ommaya spätestens 72 h nach der Cisterna Magna-Injektion zu implantieren, um sicherzustellen, dass sich die Mäuse vor der ersten Behandlung von der Operation erholen können. Forscher sollten die Wachstumsrate der CTCs in Xenograft-Modellen berechnen, bevor sie das Behandlungsschema planen.
Obwohl es andere direkte intraventrikuläre Verabreichungsmethoden gibt, wie z. B. die Verwendung eines osmotischen Pumpensystems oder einer intrazerebroventrikulären (ICV) Bolusinjektion, wie zuvor beschrieben9,gibt es mehrere Vorteile bei der Verwendung des Murine Ommaya-Modells. Zum Beispiel wird eine ICV-Bolus-Injektion in einer einzigen Verabreichung durchgeführt, während die Murine Ommaya jederzeit mehrere Dosen der Behandlung ermöglicht, unabhängig davon, ob sie als Einzelmittel oder als kombinierte Therapien verabreicht werden. Die osmotische Pumpe ist so konzipiert, dass sie bis zu 14, 28 oder 42 Tage hält, bevor die Pumpe ausgetauscht werden muss, und manchmal häufiger, wenn eine kleinere Maus mit einer kleineren Pumpe verwendet wird. Das Wechseln der osmotischen Pumpe erfordert einen chirurgischen Eingriff, der tumortragende Mäuse belastet. Ein Murine Ommaya Ersatz ist für Langzeitexperimente nicht notwendig, solange das Gerät intakt bleibt. Es minimiert auch die potenzielle Variabilität, die sich aus dem Wechsel derPumpe 9 ergibt. Implantierte Murine Ommayas in die experimentellen Mäuse blieb länger als 42 Tage intakt, und diese Dauer ermöglichte langlebige Behandlungsschemata.
Frühere Ergebnisse deuten darauf hin, dass eine pulsatile intermittierende Dosierung in den Liquor eine bessere Wirksamkeit gegen LMD hat als ein verlängerter Arzneimittelabgabeprozess durch Infusion13. Es wäre unmöglich, wiederholte Einzeldosis-Injektionen mit dem osmotischen Pumpensystem durchzuführen. Es gibt keine einfache Möglichkeit, die verbleibende eingeschlossene Flüssigkeit nach jeder Injektion auszuspülen. Die osmotische Pumpe ist auch auf die Abgabe von Mischungen kompatibler oder einzelner Medikamente beschränkt und erfordert typischerweise höhere Mengen an Arzneimittelzubereitung für die kontinuierliche Infusion. Im Gegensatz dazu ist die Murine Ommaya für genaue Mikroinjektionen von nur 3 bis 7 μL ausgelegt, ohne den toten Raum berücksichtigen zu müssen, und es gibt keine Begrenzung für die Art der Medikamente, die Forscher verwenden können, einschließlich der Immunzelltherapie. Die Murine Ommaya minimiert auch den Reagenzienabfall, wenn eine bestimmte Probe wertvoll ist, und maximiert die Nutzung dieser Ressource. Für jedes Behandlungsschema, das mehrere Dosen von Krebstherapien erfordert, ist die Murine Ommaya einfach zu bedienen, und es besteht ein minimales Risiko für Infektionen oder chirurgische Missgeschicke, mit den alternativen Ansätzen des wiederholten chirurgischen Zugriffs auf den Liquor oder durch wiederholte Entbindung mit einer Nadel. Die Murine Ommaya bietet Forschern die Flexibilität, Arzneimittelkonzentrationen und Dosierungsfrequenzen anzupassen und die Zielmodulation und Dauer der Studie entsprechend der interessierenden Forschung zu bewerten.
Eine Einschränkung der Murine Ommaya ist, dass Forscher es schwierig finden können, das Gerät in kleinere Mäuse zu implantieren. Daher ist es besser, Mäuse zu verwenden, die mindestens 8 bis 10 Wochen alt sind. Es ist möglich, dass sich die Murine Ommaya während des Behandlungsversuchs abtrichtert, wenn das Gerät während der Implantationsschritte nicht am Schädel befestigt ist und der Kleber abnutzt oder wenn die Mäuse ihn abrasiv manipuliert haben. Letzteres Szenario tritt häufiger auf, wenn mehrere Mäuse im selben Käfig untergebracht waren. Daher wird empfohlen, für die Dauer des Behandlungsplans nicht mehr als zwei Murine Ommaya-implantierte Mäuse pro Käfig unterzubringen. Dieses Protokoll wurde modifiziert, um sterilen Cyanacrylatkleber auf den Abstandhalter aufzutragen, der sich als der effektivste Klebstoff erwies, um den Abstandhalter an der Schädeloberfläche zu haften und zu verhindern, dass sich die Murine Ommaya abträcht. Die Ergebnisse zeigten, dass LMD-Mäuse von einer direkten intrathekalen Therapie über die Murine Ommaya mit erhöhtem Gesamtüberleben profitierten. Einzelne Mikrolitervolumina konnten sicher verabreicht werden, wobei die BBB umgangen wurde, wodurch die Menge der Arzneimittelzubereitung reduziert wurde. Am wichtigsten ist, dass die Mäuse, die von ZNS-Metastasen aus der Her2-Antikörper-Immuntherapie-Studie geheilt wurden, gesund geblieben sind.
Eine Zusammenarbeit mit einem Hersteller zielte darauf ab, eine MRT-kompatible Version der Murine Ommaya für das PDX-Modell von LMD zu entwickeln. Da diese Prototypversion einen Abstandhalter eingebaut hat, ist keine Montage erforderlich, was eine bessere Haftung am Schädel ermöglicht. Eine Einschränkung dieses Prototyps besteht darin, dass das Gerät zwar MRT-kompatibel ist, aber dort, wo das Gerät eingefügt wird, einen Schatten erzeugt, der die Sichtbarkeit des Bildes für Quantifizierungsanalysen verringert. Die MRT-kompatible Version ist ein gutes alternatives Werkzeug, wenn ex vivo CTC-Probenahme ein limitierender Faktor ist und eine Vormarkierung von Zellen nicht möglich ist. Die Kombination eines LMD-Xenograft-Modells und der Murine Ommaya-Technik ist vorteilhaft für die Untersuchung der direkt zielgerichteten Arzneimittelwirksamkeit unter Umgehung der BBB. Die Ergebnisse dieser In-vivo-Studien sind klinisch relevant, um rationale therapeutische Strategien für Patienten mit LMD zu entwickeln.
The authors have nothing to disclose.
Wir danken Michele L. Danielson, Tricia Favors-Watson und dem Rest des Comparative Medicine Teams an der University of South Florida für ihre technische Unterstützung und die Pflege unserer Tiere. Wir danken Instech Laboratories, Inc. für ihre Bemühungen, mit uns zusammenzuarbeiten, basierend auf unserer Anfrage, eine MRT-kompatible Murine Ommaya zu entwickeln. Diese Arbeit wird von den National Institutes of Health (NIH) R21 CA216756 (an K.S.M. Smalley), Department of Defense (DOD) W81XWH1910675 (an B. Czerniecki und P. Kalinski) und den Moffitt Cancer Center CBMM Innovative Awards (an P. Forsyth und D. Duckett) unterstützt. Redaktionelle Unterstützung leistete das Office of Scientific Writing des Moffitt Cancer Center von Dr. Paul Fletcher und Daley Drucker. Über ihre regulären Gehälter hinaus wurde keine Entschädigung gewährt.
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Phosphate-buffered saline (PBS) | Any vendor | n/a | 0.1 mm Sterile-Filtered |
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PinPort | Instech Laboratories, Inc. | #1-PNP3F28-50 | |
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