Un modelo de xenoinjerto murino de Ommaya para estudiar la terapia dirigida directamente de la enfermedad leptomeningeal

El protocolo fue aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad del Sur de Florida (IS00005974). 1. Inyección de CTC en CSF para generar un modelo LMD de ratón Preparación de los COMITÉS contra el Terrorismo Calcule el número de CTC necesarios para la inyección y prepare una suspensión unicelular a 1,0 × 104 células/μL en solución salina estéril tamponada con fosfato (PBS). Coloque la suspensión celular sobre hielo o a 4 °C durante todo el procedimiento.NOTA: Cuando use líneas celulares que requieran tripsinización, asegúrese de lavar las células dos veces con PBS estéril para eliminar la tripsina. Realice el recuento de células utilizando un hemocitómetro o un contador celular automatizado. Si se utiliza una cohorte grande (>50 ratones), haga un recuento de las células y valide la viabilidad celular entre inyecciones para garantizar que se administre un número constante de células por ratón. Procedimiento prequirúrgico Inyecte al ratón por vía subcutánea 1 mg/kg de buprenorfina de liberación sostenida (Bup-SR).NOTA: No inyecte el área de la incisión propuesta; elija un sitio de inyección bien alejado de la escápula. Anestesiar al ratón con 2-3% de isoflurano hasta que no muestre signos del reflejo de enrugamiento. Además, verifique si hay reflejo de pellizco de la cola y / o la pata para confirmar el estado de la anestesia. Prepare al ratón para la cirugía en un lugar alejado del área de operación. Recorte el sitio quirúrgico (es decir, la superficie dorsal del cráneo) con suficiente área de borde para evitar que el pelaje contamine el sitio de la incisión; luego, saturar el sitio con antiséptico de la piel germicida, trabajando desde el centro del sitio hasta la periferia, y luego dejar secar. Aplique una cortina estéril o un material de cortina plástica estéril con respaldo adhesivo para proteger el sitio quirúrgico de la contaminación.NOTA: Los instrumentos deben ser esterilizados en autoclave por adelantado y las puntas reesterilización entre los animales utilizando un esterilizador de cuentas de vidrio. Afeitar el pelaje de toda la superficie ventral de la cabeza y preparar la piel con técnica estéril. Coloque la nariz con un cono nasal modificado en forma de L del aparato estereotáctico, asegurando que las narinas permanezcan claras y abiertas. Usando cinta adhesiva a través de las superficies ventrales de ambas pinnas, tire suavemente de la piel hacia adelante para asegurarla al cono de la nariz y doble el cuello en un ángulo de aproximadamente 90 ° una vez asegurado. Administrar isoflurano al 1,5% para mantener la anestesia.NOTA: El posicionamiento adecuado dará como resultado que el área de la incisión se presente de una manera que permita la fácil identificación de la cresta caudal del hueso occipital. Coloque el cuerpo para asegurarse de que la columna vertebral se mantenga nivelada con la cisterna magna, y mientras aplica una ligera tracción a la cola, coloque cinta adhesiva en la base de la cola para asegurar. Cisterna quirúrgica inyección magna Con el cuello en plena extensión, y comenzando justo entre las pinnas, corra las puntas de la tijera quirúrgica hacia abajo con una ligera presión a través del hueso occipital.NOTA: Mientras que en esta posición de la línea media, se nota una pequeña depresión cuando las puntas de la tijera se sumergen en el área cóncava sobre la cisterna magna. Haga una pequeña incisión en la línea media de 3-5 mm justo encima de la concavidad palpada. Extraiga 5 μL de suspensión celular a 1,0 × 104 células/μL (total 5,0 × 104 células) en una jeringa Hamilton de 30 G. Use fórceps de punta roma con puntas de 1-2 mm para presionar suavemente la cisterna magna. Introduce las puntas en una posición cerrada y ábrelas mientras aplicas presión hacia abajo sobre la duramadre. Repita la disección contundente descrita en el paso anterior hasta que la membrana dural se identifique fácilmente y los vasos sanguíneos asociados sean visibles en el área expuesta.NOTA: La ventana de inyección resultante garantiza que los vasos sanguíneos no se dañan durante la inserción de la aguja. Mientras mantiene las fórceps abiertas para retraer la musculatura circundante, introduzca una aguja sin corsuras de 30 G debajo de la duramadre para visualizar el bisel. Asegúrese de que la aguja solo se introduzca justo más allá del bisel. Despliegue lentamente un émbolo de jeringa y entregue células justo debajo de la duramadre. Coloque correctamente el bisel para observar la inyección debajo de la duramadre. Administre cuidadosamente la técnica y use la aguja sin perforación de 30 G para evitar daños en la membrana y garantizar una fuga mínima. Si se observan fugas, aplique una presión suave con un aplicador con punta de algodón. Cierre la piel aplicando un clip para heridas o una microbaja de adhesivo para la piel. Una vez que la inyección se realiza con éxito, permita que los ratones se recuperen de la anestesia en una manta caliente, observándolos continuamente hasta que puedan mantener la posición esternal y demostrar un movimiento intencional. Monitoree a los ratones diariamente después de la cirugía durante la primera semana. Si un ratón parece tener dolor o angustia, trátelo con 10 mg / kg de inyección subcutánea de carprofeno una vez cada 12 a 24 h durante un aumento de 5 días según la consulta veterinaria y la directiva. Permita que los ratones se recuperen y monitoréelos durante al menos 48 a 72 h antes de continuar con el siguiente paso.NOTA: Bup-SR, administrado preventivamente, durará hasta 72 h, por lo que normalmente no son necesarios analgésicos adicionales. Sin embargo, a los animales se les proporcionará analgésico adicional según sea necesario (si están letárgicos, no comen, se agitan). Si un sitio quirúrgico desarrolla signos de infección postoperatoria (es decir, enrojecimiento, hinchazón, sensibilidad, alodinia, hiperalgesia, hiperpatía o supuración), o si el ratón está protegiendo el área afectada, eutanasia al ratón. Si las células cancerosas se inyectan con éxito en el CSF, la LMD y la progresión del tumor se desarrollarán en el SNC dentro de 1 o 2 semanas (dependiendo de los tipos de CTC o línea celular utilizada) (Figura 1). 2. Montaje e implantación de Ommaya murino Preparación de la estación Desinfectar la superficie de la estación. Coloque una cubierta azul sobre la superficie y mantenga listas todas las herramientas y suministros esterilizados indicados en la Figura 2. Procedimiento prequirúrgico Aplicar analgesia (Bup-SR) y mantener la técnica estéril descrita en la sección 1.2. Implantación quirúrgica de Ommaya murina Ensamble el dispositivo de inyección Murine Ommaya utilizando un puerto de inyección en miniatura de 25 G (0,51 mm de diámetro exterior) y un disco espaciador de 1 mm. Utilice un adhesivo estéril de cianoacrilato para asegurar la penetración de aproximadamente 2,5 mm de la cánula metálica en el hemisferio cerebral derecho(Figura 3A-C).NOTA: En este laboratorio se desarrolló un prototipo de Mouse Ommaya compatible con MRI, que ya tiene ambas partes (puerto de inyección en miniatura y espaciador) impresas en 3D juntas como una sola unidad(Figura 3D). La versión de una sola unidad fue probada por resonancia magnética y puede ahorrar tiempo al eliminar el paso de ensamblaje. Anestesiar al ratón con 2-3% de isoflurano hasta que no haya signos del reflejo de enrugamiento. Además, verifique si hay reflejo de pellizco de la cola y / o la pata para confirmar el estado de la anestesia. Afeitar toda la superficie ventral de la cabeza del pelaje y preparar la piel de acuerdo con la técnica estéril, como se describió anteriormente en el paso 1.2.3. Coloque el ratón en el aparato estereotáctico con un cono nasal para continuar la administración de isoflurano durante el procedimiento; disminuir el isoflurano al 1,5%. Apriete suavemente las barras de los oídos para asegurar la cabeza y aplique lubricante para los ojos para cubrir los ojos del ratón. Haga una pequeña incisión en la piel (3 mm), seguida de una disección contundente de los tejidos subcutáneos subyacentes para exponer el cráneo. Seque el cráneo con barras aplicadoras de punta de algodón empapadas en peróxido de hidrógeno. Perfore un orificio de rebaba en el cráneo de 0,5 mm posterior y 1,1 mm lateral del bregma, el punto anatómico del cráneo donde la sutura coronal se cruza perpendicularmente por la sutura sagital(Figura 3A),así como un orificio de rebaba de 0,9 mm para exponer la duramadre. Mueva el microdrill a un lado y puntúe suavemente el hueso que rodea inmediatamente el orificio de rebaba antes de insertar un puerto de inyección (profundidad de aproximadamente 2,5 mm), fijado al cráneo con un adhesivo estéril de cianoacrilato. Sutura de estado alrededor del punto de inyección utilizando suturas de nylon sin absorbancia 4-0 en un patrón de puntada interrumpido o sutura de cuerda de bolso11. Alojar ratones postoperatorios en jaulas individuales para la recuperación de la cirugía.NOTA: Es posible que el Ommaya murino pueda desprenderse cuando múltiples ratones recuperados por cirugía se alojan en la misma jaula, posiblemente debido a interacciones constantes de manipulación. Se recomienda que los ratones implantados con Ommaya murino se albergen individualmente (o no más de 2 ratones por jaula) en el transcurso del ensayo de eficacia del medicamento. 3. Tratamiento de Ommaya murino Dosificación de ratones usando el Murine Ommaya Anestesiar al ratón con 2-3% de isoflurano, hasta que no haya signos de reflejo de enrugamiento. Además, verifique si hay reflejo de pellizco de la cola y / o la pata para confirmar el mantenimiento de la anestesia. Acceda al Murine Ommaya utilizando un adaptador de inyección de puerto y una jeringa Hamilton. Con pinzas, sostenga la parte superior del puerto de inyección en miniatura e inserte suavemente el adaptador del inyector de puerto completamente en el tabique del puerto.NOTA: El inyector de puerto perfora el tabique del puerto de una manera que reduce el espacio muerto al mínimo y permite la inyección controlada a través de una bomba de jeringa motorizada(Figura 4A). Los tratamientos dirigidos/novedosos se inyectan a un caudal de 1 μL/min bajo anestesia. El tratamiento debe administrarse a intervalos específicos (diario / semanal) durante una duración determinada (semanas / meses), de acuerdo con la discreción del investigador.Un volumen entre 3 y 7 μL es óptimo, ya que un volumen 7 μL puede causar demasiada presión. El tamaño de la jeringa Hamilton puede variar de 10 a 100 μL, dependiendo del número de ratones en cada brazo de tratamiento. La precarga del volumen apropiado en la jeringa Hamilton evitará el reemplazo repetido de la jeringa, minimizando así los errores. Lo mejor es dedicar 1 jeringa Hamilton por brazo de tratamiento. Una vez realizada la inyección, separe el Ommaya murino del adaptador de inyección de puerto con pórceps y devuelva el ratón a la jaula para recuperarse de la anestesia, como se describe anteriormente en el paso 1.3.7. Eutanasia Sacrificar a los ratones por inhalación de dióxido de carbono (CO2)de una fuente de tanque comprimido. Exponer a los ratones a concentraciones crecientes de CO2 (es decir, se debe usar una tasa de desplazamiento del 10% al 30% del volumen de la cámara / min) para evitar o minimizar la incomodidad o la angustia. Monitoree a los ratones hasta la garantía de cese de los movimientos cardiovasculares y respiratorios.