Een Murine Ommaya Xenograft-model om direct-gerichte therapie van leptomeningeale ziekte te bestuderen

Het protocol werd goedgekeurd door de University of South Florida Institutional Animal Care and Use Committee (IS00005974). 1. Injectie van CTC’s in CSF om een LMD-model voor muizen te genereren Bereiding van CTC’s Bereken het aantal CTC’s dat nodig is voor injectie en bereid een eencellige suspensie voor op 1,0 ×10 4 cellen / μL in steriele fosfaatbuffered zoutoplossing (PBS). Plaats de celsuspensie gedurende de hele procedure op ijs of bij 4 °C.OPMERKING: Wanneer u cellijnen gebruikt die trypsinisatie vereisen, moet u cellen tweemaal wassen met steriel PBS om trypsine te verwijderen. Voer het aantal cellen uit met behulp van een hemocytometer of een geautomatiseerde celteller. Als een groot cohort (>50 muizen) wordt gebruikt, hertel dan de cellen en valideer de levensvatbaarheid van de cel tussen injecties om ervoor te zorgen dat een consistent aantal cellen per muis wordt toegediend. Prechirurgische procedure Injecteer de muis subcutaan met 1 mg/kg buprenorfine met aanhoudende afgifte (Bup-SR).OPMERKING: Injecteer het gebied van de voorgestelde incisie niet; kies een injectieplaats ver weg van de scapula. Verdoof de muis met 2-3% isofluraan totdat deze geen tekenen van de rechtreflex vertoont. Controleer bovendien op staart- en / of pootknijperreflex om de toestand van anesthesie te bevestigen. Bereid de muis voor op een operatie op een locatie ver van het operatiegebied. Clip de operatieplaats (d.w.z. het dorsale oppervlak van de schedel) met voldoende randgebied om te voorkomen dat de vacht de incisieplaats verontreinigt; verzadig vervolgens de site met kiemdodend huidantisepticum, werk vanuit het midden van de site naar de periferie en laat vervolgens drogen. Breng steriel drape of een steriel plastic drapemateriaal met kleefkracht aan om de operatieplaats te beschermen tegen verontreiniging.OPMERKING: Instrumenten moeten van tevoren worden geautoclaveerd en tips moeten opnieuw worden gesteriliseerd tussen dieren met behulp van een glazen kraalsterilisator. Scheer de vacht van het hele ventrale oppervlak van het hoofd en bereid de huid voor met behulp van een steriele techniek. Situeer de neus met een gemodificeerde L-vormige neuskegel van het stereotactische apparaat, zodat de neusgaten helder en open blijven. Gebruik tape over de ventrale oppervlakken van beide pinnae, trek de huid voorzichtig naar voren om deze aan de neuskegel vast te zetten en buig de nek in een hoek van ongeveer 90 ° zodra deze is vastgezet. Dien 1,5% isofluraan toe om de anesthesie te behouden.OPMERKING: De juiste positionering zal ertoe leiden dat het incisiegebied wordt gepresenteerd op een manier die de gemakkelijke identificatie van de caudale richel van het achterhoofdsbeen mogelijk maakt. Plaats het lichaam om ervoor te zorgen dat de wervelkolom op gelijke hoogte wordt gehouden met de cisterna magna en plaats tijdens het aanbrengen van lichte tractie op de staartband op de staartbasis om vast te zetten. Chirurgische cisterna magna injectie Met de nek in volledige extensie, en beginnend net tussen de pinnae, laat u de chirurgische schaarpunten naar beneden lopen met lichte druk over het achterhoofdsbeen.OPMERKING: In deze middellijnpositie is een kleine depressie merkbaar wanneer de schaarpunten in het holle gebied over de cisterna magna duiken. Maak een kleine 3-5 mm middellijnincisie net boven de gepalpeerde concaviteit. Trek 5 μL celsuspensie met 1,0 × 104 cellen/μL (totaal 5,0 × 104 cellen) in een Hamilton-spuit van 30 G. Gebruik een stompe tang met 1-2 mm tips om zachtjes op de cisterna magna te drukken. Breng tips in een gesloten positie en open ze terwijl u neerwaartse druk uitoefent op de dura. Herhaal stompe dissectie beschreven in de vorige stap totdat het durale membraan gemakkelijk kan worden geïdentificeerd en de bijbehorende bloedvaten zichtbaar zijn in het blootgestelde gebied.OPMERKING: Het resulterende injectievenster zorgt ervoor dat de bloedvaten onbeschadigd zijn tijdens het inbrengen van de naald. Terwijl u de tang openhoudt om de omringende spieren in te trekken, introduceert u een 30 G niet-coring naald onder de dura om de afschuining te visualiseren. Zorg ervoor dat de naald alleen net voorbij de schuine kant zelf wordt ingebracht. Zet langzaam een zuiger van de spuit in en lever cellen net onder de dura. Plaats de afschuining op de juiste manier om de injectie onder de dura te observeren. Dien de techniek zorgvuldig toe en gebruik de 30 G niet-coring naald om schade aan het membraan te voorkomen en minimale lekkage te garanderen. Als lekkage wordt opgemerkt, oefen dan zachte druk uit met een applicator met katoenen punt. Sluit de huid door een wondclip of microdruppel huidlijm aan te brengen. Zodra de injectie met succes is uitgevoerd, laat u de muizen herstellen van anesthesie op een warme deken, observeer ze continu totdat ze de sternale positie kunnen behouden en doelgerichte beweging kunnen laten zien. Controleer de muizen dagelijks na de operatie gedurende de eerste week. Als een muis pijn of angst lijkt te hebben, behandel hem dan met 10 mg / kg subcutane injectie van carprofen eenmaal per 12 tot 24 uur gedurende maximaal 5 dagen op basis van veterinair overleg en richtlijn. Laat muizen herstellen en controleer ze gedurende ten minste 48 tot 72 uur voordat u doorgaat naar de volgende stap.OPMERKING: Bup-SR, preventief gegeven, gaat tot 72 uur mee, dus extra pijnstillers zijn normaal gesproken niet nodig. Dieren krijgen echter indien nodig extra pijnstillers (als ze lethargisch zijn, niet eten, gegolfd). Als een chirurgische site tekenen van postoperatieve infectie ontwikkelt (d.w.z. roodheid, zwelling, gevoeligheid, allodynie, hyperalgesie, hyperpathie of ettering), of als de muis het getroffen gebied bewaakt, euthanaseer de muis dan. Als kankercellen met succes in de liquor worden geïnjecteerd, zullen LMD en tumorprogressie zich binnen 1 of 2 weken in het CZS ontwikkelen (afhankelijk van de soorten CTC’s of gebruikte cellijn) (figuur 1). 2. Murine Ommaya assemblage en implantatie Voorbereiding van het station Desinfecteer het oppervlak van het station. Plaats een blauwe bekleding over het oppervlak en houd alle gesteriliseerde gereedschappen en benodigdheden die in figuur 2 worden aangegeven,gereed. Prechirurgische procedure Breng analgesie (Bup-SR) aan en handhaaf de steriele techniek zoals beschreven in rubriek 1.2. Chirurgische implantatie van Murine Ommaya Monteer het Murine Ommaya-injectieapparaat met behulp van een miniatuurinjectiepoort van 25 G (0,51 mm buitendiameter) en een afstandsschijf van 1 mm. Gebruik een cyanoacrylaat steriele lijm om de penetratie van ongeveer 2,5 mm van de metalen canule in de rechter hersenhelft te garanderen (Figuur 3A-C).OPMERKING: Een MRI-compatibel Mouse Ommaya-prototype werd ontwikkeld in dit laboratorium, dat beide onderdelen (miniatuur injectiepoort en spacer) al 3D-geprint samen als een enkele eenheid heeft(Figuur 3D). De versie met één eenheid is getest door MRI en kan tijd besparen door de montagestap te elimineren. Verdoof de muis met 2-3% isofluraan totdat er geen tekenen van de rechtreflex zijn. Controleer verder op staart- en / of pootknijperreflex om de toestand van anesthesie te bevestigen. Scheer het gehele ventrale oppervlak van de kop van de vacht en bereid de huid voor volgens de steriele techniek, zoals eerder beschreven in stap 1.2.3. Plaats de muis in het stereotactische apparaat met een neuskegel om de toediening van isofluraan tijdens de procedure voort te zetten; verlaag het isofluraan tot 1,5%. Draai de oorstaven voorzichtig aan om het hoofd vast te zetten en breng oogsmeermiddel aan om de ogen van de muis te bedekken. Maak een kleine huidincisie (3 mm), gevolgd door stompe dissectie van de onderliggende onderhuidse weefsels om de schedel bloot te leggen. Droog de schedel met behulp van met waterstofperoxide doordrenkte applicatorsticks met wattenpunt. Boor een braamgat in de schedel 0,5 mm achteraan en 1,1 mm lateraal van de bregma – het anatomische punt op de schedel waar de coronale hechting loodrecht wordt doorsneden door de sagittale hechting (figuur 3A) – evenals een braamgat van 0,9 mm om de dura mater bloot te leggen. Beweeg de microdrill opzij en scoor voorzichtig het bot direct rond het braamgat voordat u een injectiepoort (diepte van ongeveer 2,5 mm) inbrengt, die met een steriele lijm van cyanoacrylaat op de schedel is aangebracht. Hechting rond de injectieplek met behulp van 4-0 nylon hechtingen zonder absorptie in een onderbroken steekpatroon of een hechting van detasstring 11. Huis postoperatieve muizen in individuele kooien voor operatieherstel.OPMERKING: Het is mogelijk dat de Murine Ommaya loskomt wanneer meerdere door operaties herstelde muizen in dezelfde kooi worden gehuisvest, mogelijk als gevolg van constante manipulatie-interacties. Het wordt aanbevolen dat Murine Ommaya-geïmplanteerde muizen individueel (of niet meer dan 2 muizen per kooi) worden gehuisvest in de loop van de werkzaamheidsproef van het geneesmiddel. 3. Murine Ommaya behandeling Muizen dozen met de Murine Ommaya Verdoof de muis met 2-3% isofluraan, totdat er geen tekenen van rechtreflex zijn. Controleer verder op staart- en / of pootknijpreflex om het behoud van de anesthesie te bevestigen. Toegang tot de Murine Ommaya met behulp van een poortinjectieadapter en een Hamilton-spuit. Houd met behulp van een tang de bovenkant van de miniatuurinjectiepoort vast en steek de poortinjectoradapter voorzichtig volledig in het septum van de poort.OPMERKING: De poortinjector doorboort het septum van de poort op een manier die dode ruimte tot een minimum beperkt en gecontroleerde injectie mogelijk maakt via een gemotoriseerde spuitpomp(figuur 4A). Gerichte/nieuwe behandelingen worden geïnjecteerd met een stroomsnelheid van 1 μL/min onder narcose. De behandeling moet worden gegeven met bepaalde tussenpozen (dagelijks / wekelijks) voor een bepaalde duur (weken / maanden), volgens de discretie van de onderzoeker.Een volume tussen 3 en 7 μL is optimaal, omdat een volume 7 μL te veel druk kan veroorzaken. De grootte van de Hamilton-spuit kan variëren van 10 tot 100 μL, afhankelijk van het aantal muizen in elke behandelingsarm. Door het juiste volume vooraf in de Hamilton-spuit te laden, voorkomt u herhaalde vervanging van de spuit, waardoor fouten tot een minimum worden belet. Het is het beste om 1 Hamilton-spuit per behandelingsarm te wijden. Zodra de injectie is gemaakt, maakt u de Murine Ommaya los van de poortinjectieadapter met behulp van een tang en brengt u de muis terug naar de kooi om te herstellen van de anesthesie, zoals hierboven beschreven in stap 1.3.7. Euthanasie Euthanaseer de muizen door inademing van koolstofdioxide (CO2)uit een gecomprimeerde tankbron. Stel de muizen bloot aan toenemende concentraties CO2 (d.w.z. een verplaatsingssnelheid van 10% tot 30% van het kamervolume / min moet worden gebruikt) om ongemak of angst te voorkomen of te minimaliseren. Controleer de muizen totdat de stopzetting van cardiovasculaire en respiratoire bewegingen is verzekerd.