Leptomeningeal Hastalığın Doğrudan Hedefli Tedavisini Incelemek için Bir Murine Ommaya Xenograft Modeli
Summary
Burada, hastalarda fonksiyonel olarak bir Ommaya rezervuarı andıran bir murine ksinograft modelini tarif ediyoruz. Murine Ommaya’yı evrensel olarak ölümcül leptomeningeal hastalık için yeni terapötikleri incelemek için geliştirdik.
Abstract
Leptomeningeal hastalık (LMD), serebral omurilik sıvısına (CSF) nadir görülen bir merkezi sinir sistemi (CNS) metastazı türüdür. LMD’ye neden olan en yaygın kanserler meme ve akciğer kanserleri ve melanomdur. LMD tanısı alan hastaların prognozu çok zayıftır ve genellikle sadece birkaç hafta veya ay hayatta kalırlar. LMD’ye karşı sistemik tedavinin etkinliğinin olmamasının olası bir nedeni, koroid pleksus boyunca bozulmamış ve nispeten geçirimsiz bir kan-beyin bariyeri (BBB) veya kan-CSF bariyeri nedeniyle CSF’de terapötik olarak etkili ilaç konsantrasyonlarının elde edilememesidir. Bu nedenle, ilaçların intratekal veya intraventriküler olarak doğrudan uygulanması bu engelleri aşabilir. Bu grup, terapötiklerin (yani ilaçlar, antikorlar ve hücresel tedaviler) kronik olarak etkili bir şekilde verilmesini ve CSF’deki ilaç konsantrasyonlarını ve hedef modülasyonu belirlemek için (farelerde tümör mikroçevrasyonu hedeflendiğinde) CSF’nin tekrarlanan örneklemesine izin veren bir model geliştirmiştir. Model, klinik olarak kullanılan manyetik rezonans görüntüleme uyumlu Ommaya rezervuarının murine eşdeğeridir. Kafatasına yapıştırılmış olan bu model “Murine Ommaya” olarak belirlenmiştir. Kavram terapötik bir kanıt olarak, insan epidermal büyüme faktörü reseptörü 2 antikor (klon 7.16.4), insan epidermal büyüme faktörü reseptörü 2-pozitif meme kanserinden LMD’li fareleri tedavi etmek için Murine Ommaya aracılığıyla CSF’ye teslim edildi. Murine Ommaya, minyatür bir erişim portu kullanarak ilaç teslimatının verimliliğini arttırır ve fazla ilacın yanlış kullanımını önler; moleküler ve immünolojik çalışmalar için CSF örneklemesi ile müdahale etmez. Murine Ommaya, LMD’nin deneysel modellerinde yeni terapötikleri test etmek için yararlıdır.
Introduction
Leptomeningeal hastalık (LMD), tümör hücrelerinin CSF’ye erişip beyin ve omurilik yüzeyine sızdığı CNS’nin agresif bir geç evre metastazıdır1. LMD’ye neden olan en yaygın kanserler meme ve akciğerin yanı sıra melanom2. LMD, baş ağrısı, kraniyal sinir felci, sert boyun ve radyülopatiler gibi bir dizi nörolojik semptom ve belirti ile sonuçlanır. LMD’li hastalar için prognoz genellikle çok zayıftır (ortalama sağkalım haftalar içinde ölçülür) ve evrensel olarak ölümcüldür3, 4,5,6,7. Cerrahi, radyasyon ve sistemik kemoterapi ile tedavi palyatiftir. LMD için sistemik tedavi, koroid pleksus1boyunca sağlam bir BBB veya kan-CSF bariyeri boyunca CSF’ye yetersiz ilaç penetrasyonu nedeniyle başarısız olabilir.
Bu nedenle, kanser terapötiklerinin (örneğin, kontrol noktası inhibitörleri ve hücresel tedaviler de dahil olmak üzere ilaçlar ve antikor bazlı tedaviler) doğrudan CSF’ye uygulanması bu sınırlamayı aşabilir8. Hastalardan CSF’ye erişmek ve örneklemek, kafa derisinin altına yerleştirilen bir Ommaya rezervuarı aracılığıyla mümkündür. Bu cihaz, kanser ajanlarının (örneğin metotreksat ve trastuzumab) yanı sıra tanı çalışmaları için CSF örneklemesi (örneğin, LMD’nin sitolojik tanısı tedaviye yanıtları izlemek için) spinal tap yapmadan verilmesine izin verir. Klinik olarak kullanılanları taklit etmek için bir murine Ommaya rezervuarı tasarlanmıştır. Rezervuar, erişen bir bağlantı noktası ve ara parçanın montajını ve cihazın ilaç çalışması süresince kalıcı olarak bozulmadan kalmasını sağlayan fare cannülasyon tekniğinin değiştirilmesini gerektirir. Bu cihaz “Murine Ommaya” olarak belirlenmiştir.
Sık enjeksiyonlar9üzerinde borudaki boş alanı önceden doldurmak için fazla sıvı hacimlerinin hazırlanmasını ve sürekli infüzyon gerektiren ozmotik infüzyon pompası tekniğinin aksine, Murine Ommaya ilaç çözeltilerinin wastage’ını en aza indirir. Hamilton şırınd, minyatür erişim portsu ve otomatik enjektör kullanarak CSF’ye küçük miktarlarda (3-7 μL) herhangi bir zamanda birden fazla tek doz tedavinin etkili bir şekilde kullanılmasına izin verir. Gerçek zamanlı olarak, LMD’ye karşı test ilaçlarının etkinliği görüntüleme ile belirlenebilir. Bu yaklaşım kullanılarak, in vivo bulguları hastalar için rasyonel tedavi stratejilerine çevirmek için LMD’ye karşı çeşitli kemoterapiler, antikorlar ve hücre immünoterapileri (tek veya kombine ajanlar olarak) test edilebilir. LMD’nin hasta kaynaklı bir ksinograft (PDX) modelinin görüntüleme kapasitesini daha da geliştirmek için, Murine Ommaya’nın montaj gerektirmeyen ve kullanıma hazır manyetik rezonans görüntüleme (MRI) uyumlu bir versiyonunu geliştirmek için bir üretici ile işbirliği yapıldı. MRI yeteneği, özellikle CSF’den dolaşımdaki tümör hücrelerinin (CTC) miktarının bazen sınırlayıcı faktör olduğu PDX modelleri için ve genellikle CCC’leri önceden etiketlemenin mümkün olmadığı durumlarda faydalıdır.
Bu makalede, fareleri LMD ile işlemek için CTC’lerin enjeksiyonu ile başlayan ayrıntılı bir protokol açıklanmaktadır. Murine Ommaya daha sonra cerrahi olarak implante edilir ve Murine Ommaya aracılığıyla birden fazla ilaç tedavisi adımı atılmıştır. Gösteri için bir kavram kanıtı olarak, klon 7.16.4 (trastuzumab’ın insan eşdeğeri) adı verilen murine insan epidermal büyüme faktörü reseptörü 2 (Her2) antikorunun10. Antikor, Her2+ meme kanseri hücrelerini Murine Ommaya (doğrudan hedefli veya intratekal tedavi) veya intraperitoneal enjeksiyon (sistemik tedavi) yoluyla hedefler. Sonuçlar, doğrudan intratekal immünoterapi alan LMD’li farelerin sistemsel olarak aynı tedavi ile tedavi edilenlerden önemli ölçüde daha uzun yaşadığını göstermiştir. Murine Ommaya yoluyla tedavi edilen farelerdeki CNS metastazları, tedavinin üçüncü haftasının üçüncü dozu ile neredeyse tamamen geriledi ve bu da genel sağkalımda iyileşmeye neden oldu.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada, Murine Ommaya, LMD ve diğer CNS ile ilgili hastalıkların preklinik modellerinde kanser önleyici ajanların CSF alanına tekrar tekrar yönetilmesini sağlayan güvenilir bir model olarak tanımlanmıştır. Cihaz hala kesintisiz olarak takılıyken farelerden CSF örneği alındı. Bu doğrudan hedefli terapi ksinograft modeli, LMD için rasyonel tedavi stratejileri geliştirme ve test etme konusunda önemli bir adımdır. Sarnıç magna enjeksiyonlarından LMD gelişiminin ilk belirtisine kadar geçen süre kanser hücre tipine bağlı olarak değişmektedir. LMD ve CNS metastazları CTC aşılamadan yaklaşık 1 veya 2 hafta sonra oluşmaya başlar. Oldukça proliferatif bir kanser hücre hattı kullanılırsa, metastazın <7 gün içinde ortaya çıkması mümkündür. Bu durumda tümör büyümesine bağlı damarlanma bazen Murine Ommaya implantasyonunu zorlaştırır. Bu zorluğun bir çözümü, CSF alanına enjeksiyon için kanser hücrelerinin sayısını azaltmak ve tümör gelişiminden önce daha fazla zaman sağlamaktır. Ayrıca, bu protokol, farelerin ilk tedaviden önce ameliyattan kurtulması için yeterli zaman sağlamak için sarnıç magna enjeksiyonundan en geç 72 saat sonra Murine Ommaya'yı yerleştirmek için optimize edilmiştir. Araştırmacılar tedavi rejimini planlamadan önce ksnograft modellerinde CTC'lerin büyüme oranını hesaplamalıdır.
Daha önce açıklandığı gibi, osmotik pompa sistemi veya intraserebroventriküler (ICV) bolus enjeksiyonu gibi diğer doğrudan intraventriküler doğum yöntemleri olmasınarağmen,Murine Ommaya modelini kullanmanın çeşitli avantajları vardır. Örneğin, bir ICV bolus enjeksiyonu tek bir doğumda yapılırken, Murine Ommaya, ister tek bir ajan ister kombine tedaviler olarak verilen herhangi bir zamanda birden fazla tedavi dozuna izin verir. Ozmotik pompa, pompanın değiştirilmesi gerektiğinden önce 14, 28 veya 42 güne kadar ve bazen daha küçük bir pompaya sahip daha küçük bir fare kullanıldığında daha sık dayanacak şekilde tasarlanmıştır. Ozmotik pompanın değiştirilmesi, tümör taşıyan farelere stres katan cerrahi bir prosedür gerektirir. Cihaz bozulmadan kaldığı sürece uzun süreli deneyler için Bir Murine Ommaya değişimi gerekli değildir. Ayrıca pompanın değiştirilmesinden kaynaklanan olası değişkenliği en aza indirir9. Deneysel farelere yerleştirilen Murine Ommayas 42 günden daha uzun süre bozulmadan kaldı ve bu süre uzun ömürlü tedavi rejimlerine izin verdi.
Önceki bulgular, CSF’ye pulsatile aralıklı dozlamanın LMD’ye karşı infüzyon13ile uzun süreli bir ilaç dağıtım sürecinden daha iyi bir etkinliği olduğunu göstermektedir. Ozmotik pompa sistemini kullanarak tekrarlanan tek doz enjeksiyonları yapmak imkansızdır. Her enjeksiyondan sonra kalan sıkışmış sıvıyı temizlemenin kolay bir yolu yoktur. Ozmotik pompa ayrıca uyumlu veya tek ilaçların karışımlarını sunmakla sınırlıdır ve tipik olarak sürekli infüzyon için daha yüksek miktarlarda ilaç hazırlama gerektirir. Buna karşılık, Murine Ommaya, ölü alanı hesaba katmak zorunda kalmadan 3 ila 7 μL kadar düşük doğru mikro enjeksiyonlar için tasarlanmıştır ve araştırmacıların kullanabileceği ilaç türünde bağışıklık hücresi tedavisi de dahil olmak üzere herhangi bir sınırlama yoktur. Murine Ommaya ayrıca belirli bir örnek değerliyse reaktif atıklarını en aza indirir ve bu kaynağın kullanımını en üst düzeye çıkarır. Birden fazla doz anti-kanser tedavisi gerektiren herhangi bir tedavi rejimi için, Murine Ommaya’nın kullanımı kolaydır ve CSF’ye cerrahi olarak veya iğne ile tekrarlanan doğum yoluyla tekrar tekrar erişme alternatif yaklaşımları ile enfeksiyon veya cerrahi talihsizlik riski minimumdur. Murine Ommaya, araştırmacılara ilaç konsantrasyonlarını ve dozlama frekanslarını ayarlama ve ilgi alanı araştırmasına göre hedef modülasyonunu ve çalışma süresini değerlendirme esnekliği sağlar.
Murine Ommaya’nın bir sınırlaması, araştırmacıların cihazı daha küçük farelere yerleştirmeyi zor bulabilecekleridir. Bu nedenle, en az 8 ila 10 haftalık fareler kullanmak daha iyidir. Cihaz implantasyon adımları sırasında kafatasına sabitlenmezse ve tutkal aşınırsa veya fareler onu aşındırıcı bir şekilde kurcalamışsa, Murine Ommaya’nın tedavi denemesi sırasında çıkması mümkündür. İkinci senaryo, birden fazla fare aynı kafeste barındırıldığında daha sık ortaya çıkar. Bu nedenle, tedavi programı süresince kafes başına en fazla iki Murine Ommaya implante farenin barındırılması önerilir. Bu protokol, ara parçayı kafatası yüzeyine yapıştırmak ve Murine Ommaya’nın çıkmasını önlemek için en etkili tutkal olduğu tespit edilen aralığa siyanoakrilat steril yapıştırıcı uygulamak için değiştirildi. Sonuçlar, LMD farelerinin Murine Ommaya aracılığıyla doğrudan intratekal tedaviden yararlandığını ve genel sağkalımın arttığını göstermiştir. Tek mikroliter hacimleri BBB’yi atlayarak güvenli bir şekilde uygulanabilir, böylece ilaç hazırlama miktarı azaltılabilir. En önemlisi, Her2-antikor immünoterapi çalışmasından CNS metastazlarından iyileşen fareler sağlıklı kalmıştır.
LMD’nin PDX modeli için Murine Ommaya’nın MRI uyumlu bir sürümünü geliştirmeyi amaçlayan bir üreticiyle işbirliği. Bu prototip versiyonun dahil edilmiş bir aralayıcısı olduğundan, kafatasına daha iyi yapışmasını sağlayan bir montaj gerekmez. Bu prototipin bir sınırlaması, cihaz MRI uyumlu olmasına rağmen, cihazın yerleştirildiği yerde bir gölge oluşturması ve bu da nicelik analizleri için görüntünün görünürlüğünü azaltmasıdır. EX VIVO CTC örneklemesi sınırlayıcı bir faktör olduğunda ve prelabeling hücreleri mümkün olmadığında MRI uyumlu versiyon iyi bir alternatif araçtır. Bir LMD ksenograft modeli ve Murine Ommaya tekniğinin kombinasyonu, BBB’yi atlayarak doğrudan hedefli ilaç etkinliğini incelemek için faydalıdır. Bu in vivo çalışmalardan elde edilen sonuçlar klinik olarak LMD’li hastalar için rasyonel terapötik stratejiler tasarlamakla ilgilidir.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Michele L. Danielson, Tricia Favors-Watson ve Güney Florida Üniversitesi Karşılaştırmalı Tıp ekibinin geri kalanına teknik destekleri ve hayvanlarımızın bakımları için teşekkür ederiz. Instech Laboratories, Inc.’e MRI uyumlu bir Murine Ommaya geliştirme talebimize dayanarak bizimle birlikte çalıştıkları için teşekkür ederiz. Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) R21 CA216756 (K.S.M. Smalley’e), Savunma Bakanlığı (DOD) W81XWH1910675 (B. Czerniecki ve P. Kalinski’ye) ve Moffitt Kanser Merkezi CBMM Yenilikçi Ödülleri (P. Forsyth ve D. Duckett’e) tarafından desteklenmektedir. Editoryal yardım, Moffitt Kanser Merkezi Bilimsel Yazma Ofisi tarafından Dr. Paul Fletcher ve Daley Drucker tarafından sağlanmıştır. Normal maaşlarının ötesinde bir tazminat verilmedi.
Materials
| 1 mm spacer disc | Alzet, Durect Corporation | #0008670 | Spacer disc only |
| 4-0 ethilon nylon suture | Any vendor | n/a | |
| Automatic syringe pumps | Harvard Syringe Pumps (or any vendor) | #70-4505 | Pump 11 Elite |
| Bead sterilizer | Braintree Scientific Inc. (or any vendor) | #GER 5287-120V | Germinator 500 |
| Buprenorphine Sustained-Release (Bup-SR) | Zoopharm | DEA controlled | |
| Cyanoacrylate sterile adhesive | Any vendor | ||
| Gas inhalation anestehsia system | VeteEquip | #901812 | COMPAC5 |
| Hamilton microliter syringes | Hamilton | 10, 25, 50, and 100 μL | 30 G for cisterna magna injection |
| Hydrogen peroxide | Any vendor | n/a | |
| IVIS 200 imaging system | Caliper Life Sciences | n/a | |
| Magnifying glass with light | Any vendor | n/a | |
| Microdrill | Stoelting (or any vendor) | #51555M | |
| MRI imaging | Bruker | BioSpec series | Optional |
| Murine Ommaya (MRI-compatible) prototype | Instech Laboratories, Inc. | #VAB620-25MRI-3.3 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Any vendor | n/a | 0.1 mm Sterile-Filtered |
| PinPort injector | Instech Laboratories, Inc. | #PNP3M-50 | |
| PinPort | Instech Laboratories, Inc. | #1-PNP3F28-50 | |
| Rodent Surgical Instruments (Scissors, Forceps) | Roboz Surgical Instrument (or any vendor) | ||
| Stereotaxic device | Stoelting (or any vendor) | #51730M | |
| Sterile blue paper/ drape covering | Any vendor | n/a | n/a |
| Sterile cotton sticks | Any vendor | n/a |
References
- Chamberlain, M. C. Leptomeningeal metastasis. Current Opinion in Neurology. 22 (6), 665-674 (2009).
- Nayar, G., et al. Leptomeningeal disease: current diagnostic and therapeutic strategies. Oncotarget. 8 (42), 73312-73328 (2017).
- Shapiro, W. R., Johanson, C. E., Boogerd, W. Treatment modalities for leptomeningeal metastases. Seminars in Oncology. 36 (4), 46-54 (2009).
- Davies, M. A., et al. Prognostic factors for survival in melanoma patients with brain metastases. Cancer. 117 (8), 1687-1696 (2011).
- Znidaric, T., et al. Breast cancer patients with brain metastases or leptomeningeal disease: 10-year results of a national cohort with validation of prognostic indexes. Breast Journal. 25 (6), 1117-1125 (2019).
- Glitza, I. C., et al. Leptomeningeal disease in melanoma patients: An update to treatment, challenges, and future directions. Pigment Cell & Melanoma Research. 33 (4), 527-541 (2020).
- Raizer, J. J., et al. Brain and leptomeningeal metastases from cutaneous melanoma: survival outcomes based on clinical features. Neuro-oncology. 10 (2), 199-207 (2008).
- Taillibert, S., et al. Leptomeningeal metastases from solid malignancy: a review. Journal of Neurooncology. 75 (1), 85-99 (2005).
- DeVos, S. L., Miller, T. M. Direct intraventricular delivery of drugs to the rodent central nervous system. Journal of Visualized Experiments. (75), e50326 (2013).
- Kodumudi, K. N., et al. Sequential anti-PD1 therapy following dendritic cell vaccination improves survival in a HER2 mammary carcinoma model and identifies a critical role for CD4 T cells in mediating the response. Frontiers in Immunology. 10, 1939 (2019).
- Dunn, L., et al. Murine model of wound healing. Journal of Visualized Experiments. (75), e50265 (2013).
- Simon, M. J., Iliff, J. J. Regulation of cerebrospinal fluid (CSF) flow in neurodegenerative, neurovascular and neuroinflammatory disease. Biochimica et Biophysica Acta. 1862 (3), 442-451 (2016).
- Shackleford, G. M., et al. Continuous and bolus intraventricular topotecan prolong survival in a mouse model of leptomeningeal medulloblastoma. PLoS One. 14 (1), 0206394 (2019).
