نموذج مورين أومايا زينوغرافت لدراسة العلاج المباشر المستهدف لمرض اللبتومينينجال
Summary
هنا، ونحن نصف نموذج زينوغرافت مورين الذي يشبه وظيفيا خزان أومايا في المرضى. طورنا مورين أوميا لدراسة العلاجات الجديدة لمرض اللبتومينينيال القاتل عالميا.
Abstract
مرض اللبتومينينجال (LMD) هو نوع غير شائع من انبثاث الجهاز العصبي المركزي (CNS) إلى السائل الشوكي الدماغي (CSF). السرطانات الأكثر شيوعا التي تسبب LMD هي سرطان الثدي والرئة وسرطان الجلد. المرضى الذين تم تشخيصهم مع LMD لديهم تشخيص سيئة للغاية والبقاء على قيد الحياة عموما لبضعة أسابيع أو أشهر فقط. أحد الأسباب المحتملة لعدم فعالية العلاج الجهازي ضد LMD هو الفشل في تحقيق تركيزات فعالة علاجيا من المخدرات في CSF بسبب حاجز الدم الدماغي السليم وغير منفذ نسبيا (BBB) أو حاجز الدم CSF عبر الضفيرة المشيمية. لذلك، قد إدارة مباشرة المخدرات داخل الثكال أو intraventricularly التغلب على هذه الحواجز. وقد وضعت هذه المجموعة نموذجا يسمح لتقديم فعال للعلاجات (أي الأدوية والأجسام المضادة والعلاجات الخلوية) بشكل مزمن وأخذ عينات متكررة من CSF لتحديد تركيزات المخدرات والتحوير المستهدف في CSF (عندما يتم استهداف البيئة الدقيقة الورم في الفئران). النموذج هو ما يعادل مورين من خزان أومايا متوافق مع التصوير بالرنين المغناطيسي، والذي يستخدم سريريا. وقد تم تعيين هذا النموذج، الملصق على الجمجمة، باسم “مورين أومايا”. كدليل علاجي على المفهوم ، تم تسليم مستقبلات عامل نمو البشرة البشرية 2 الأجسام المضادة (استنساخ 7.16.4) إلى CSF عبر Murine Ommaya لعلاج الفئران المصابة بال LMD من مستقبلات عامل نمو البشرة البشرية 2 إيجابية سرطان الثدي. وOmmaya مورين يزيد من كفاءة تسليم المخدرات باستخدام منفذ وصول مصغرة ويمنع هدر المخدرات الزائدة; لا تتداخل مع أخذ عينات CSF للدراسات الجزيئية والمناعية. وOmmaya مورين مفيد لاختبار العلاجات الرواية في النماذج التجريبية من LMD.
Introduction
مرض اللبتومينينجال (LMD) هو الانبثاث العدواني في مرحلة متأخرة من الجهاز العصبي المركزي ، حيث الخلايا السرطانية الوصول إلى CSF والتسلل إلى سطح الدماغ والحبل الشوكي1. وتشمل أنواع السرطان الأكثر شيوعا التي تسبب LMD تلك الثدي والرئة، فضلا عن سرطان الجلد2. ينتج عن LMD عدد من الأعراض والعلامات العصبية مثل الصداع والشلل العصبي القحفي وتصلب الرقبة وامراض الراديكولوباث. تشخيص المرضى الذين يعانون من LMD عموما سيئة جدا (يقاس متوسط البقاء على قيد الحياة في أسابيع) وقاتلة عالميا3,4,5,6,7. العلاج بالجراحة والإشعاع والعلاج الكيميائي الجهازي هو علاج ملطف. قد يفشل العلاج الجهازي لLMD بسبب عدم كفاية اختراق الدواء في CSF عبر BBB سليمة أو حاجز الدم CSF عبر الضفيرة المشيمية1.
لذلك ، قد إدارة علاجات السرطان (على سبيل المثال ، الأدوية والعلاجات القائمة على الأجسام المضادة بما في ذلك مثبطات نقاط التفتيش والعلاجات الخلوية) مباشرة في CSF التغلب على هذا القيد8. الوصول وأخذ العينات CSF من المرضى ممكن من خلال خزان أومايا التي يتم زرعها تحت فروة الرأس. يسمح هذا الجهاز بإدارة عوامل السرطان (على سبيل المثال، الميثوتريكسات و trastuzumab) وكذلك أخذ عينات من CSF للدراسات التشخيصية (على سبيل المثال، التشخيص الخلوي ل LMD لرصد الاستجابات للعلاج) دون إجراء نقرة في العمود الفقري. تم تصميم خزان مورين أومايا لمحاكاة تلك المستخدمة سريريا. يتطلب الخزان تجميع منفذ الوصول وقطع المسافة وتعديل تقنية قنية الماوس ، والتي تسمح للجهاز بالبقاء سليما بشكل دائم طوال مدة دراسة الدواء. وقد تم تعيين هذا الجهاز باسم “مورين أومايا”.
على النقيض من تقنية مضخة ضخ التناضح ، والتي تتطلب إعداد كميات السائل الزائدة لملء المساحة الفارغة في الأنابيب والضخ المستمر على الحقنالمتكررة 9، يقلل Murine Ommaya من إهدار حلول الأدوية. وهو يسمح بالإدارة الفعالة لجرعات واحدة متعددة من العلاجات في أي وقت بكميات صغيرة (3-7 ميكرولتر) في CSF باستخدام حقنة هاملتون ، ومنفذ وصول مصغر ، وحقن تلقائي. في الوقت الحقيقي ، يمكن تحديد فعالية أدوية الاختبار ضد LMD عن طريق التصوير. باستخدام هذا النهج، يمكن اختبار مجموعة متنوعة من العلاج الكيميائي والأجسام المضادة والعلاجات المناعية للخلايا (كعوامل واحدة أو مجتمعة) ضد LMD لترجمة نتائج الجسم الحي إلى استراتيجيات علاج عقلانية للمرضى. لزيادة تحسين القدرة على التصوير لنموذج xenograft مشتق من المريض (PDX) من LMD ، تم التعاون مع الشركة المصنعة لتطوير نسخة متوافقة مع التصوير بالرنين المغناطيسي (MRI) من مورين أومايا ، والتي لا تتطلب أي تجميع وجاهزة للاستخدام. إن قدرة التصوير بالرنين المغناطيسي مفيدة ، خاصة بالنسبة لنماذج PDX التي تكون فيها كمية الخلايا السرطانية المتداولة (CTCs) من CSF هي في بعض الأحيان العامل المقيد ، وفي كثير من الأحيان عندما تكون CTCs السابقة للتشفير غير مجدية.
تصف هذه الورقة بروتوكول مفصل يبدأ بحقن CTCs لتقديم الفئران مع LMD . ثم يتم زرع مورين أومايا جراحيا، ويتم تنفيذ خطوات متعددة للعلاج من المخدرات عن طريق مورين أومايا. كدليل على مفهوم للمظاهرة، تم إجراء مقارنة في الجسم الحي جنبا إلى جنب، والتي تم تسليم مورين الإنسان مستقبلات عامل نمو البشرة 2 (Her2) الأجسام المضادة تسمى استنساخ 7.16.4 (المعادل البشري من trastuzumab)10. يستهدف الجسم المضاد Her2+ خلايا سرطان الثدي إما عن طريق مورين أومايا (العلاج المباشر المستهدف أو داخل الرحم) أو عن طريق الحقن داخل الصفاق (العلاج الجهازي). وأظهرت النتائج أن الفئران مع LMD التي تلقت العلاج المناعي داخل الثكال مباشرة عاش لفترة أطول بكثير من تلك التي عولجت مع نفس العلاج بشكل منهجي. وتراجعت الانبثاث CNS في الفئران المعالجة عن طريق أومايا مورين تماما تقريبا من الجرعة الثالثة من الأسبوع الثالث من العلاج، مما أدى إلى تحسين البقاء على قيد الحياة بشكل عام.
Protocol
Representative Results
Discussion
هنا، وقد وصفت مورين أومايا كنموذج موثوق بها، والذي يسمح للإدارة المتكررة للعوامل المضادة للسرطان في الفضاء CSF في نماذج ما قبل السريرية من LMD وغيرها من الأمراض المرتبطة CNS. تم أخذ عينات CSF من الفئران في حين كان الجهاز لا يزال متصلا دون انقطاع. هذا العلاج المستهدف مباشرة xenograft نموذج خطوة هامة في تطوير واختبار استراتيجيات العلاج العقلاني لLMD. الوقت من حقن ماجنا cisterna إلى العلامة الأولية للتنمية LMD يختلف تبعا لنوع الخلية السرطانية. تبدأ نقائل LMD وCNS في التشكل بعد حوالي أسبوع أو أسبوعين من تلقيح CTC. إذا تم استخدام خط خلايا سرطانية شديدة الانتشار، فمن الممكن أن يحدث الانبثاث في <7 أيام. في هذه الحالة، يمكن أن الأوعية الدموية بسبب نمو الورم في بعض الأحيان يجعل زرع أومايا مورين تحديا. أحد الحلول لهذا التحدي هو تقليل عدد الخلايا السرطانية للحقن في الفضاء CSF، مما يسمح لمزيد من الوقت قبل تطور الورم. وعلاوة على ذلك، تم تحسين هذا البروتوكول لزرع أومايا مورين في موعد لا يتجاوز 72 ساعة بعد حقن ماجنا cisterna لضمان ما يكفي من الوقت للفئران للتعافي من الجراحة قبل العلاج الأول. يجب على الباحثين حساب معدل نمو CTCs في نماذج xenograft قبل التخطيط لنظام العلاج.
على الرغم من أن هناك طرق أخرى مباشرة التسليم داخل البطين, مثل استخدام نظام مضخة التناضح أو حقن بولوس intracerebroventricular (ICV) , كما هو موضح سابقا9, هناك العديد من المزايا لاستخدام نموذج مورين أومايا. على سبيل المثال، يتم حقن البولوس ICV في ولادة واحدة، في حين أن مورين أومايا يسمح لجرعات متعددة من العلاج في أي وقت، سواء أعطيت كعامل واحد أو كعلاجات مجتمعة. تم تصميم المضخة التناضحية للحفاظ على ما يصل إلى 14 أو 28 أو 42 يوما قبل أن تحتاج المضخة إلى استبدال ، وفي بعض الأحيان أكثر إذا تم استخدام فأر أصغر مع مضخة أصغر. يتطلب تغيير المضخة التناضحية إجراء جراحيا ، مما يضيف إجهادا إلى الفئران الحاملة للورم. استبدال مورين أومايا ليس ضروريا للتجارب طويلة الأمد طالما بقي الجهاز سليما. كما أنه يقلل من التقلبات المحتملة التي تنتج عن تغيير المضخة9. ظلت مورين أوماياس المزروعة في الفئران التجريبية سليمة لأكثر من 42 يوما ، وسمحت هذه المدة بأنظمة علاج طويلة الأجل.
تشير النتائج السابقة إلى أن التعاطي المتقطع النابض في CSF له فعالية أفضل ضد LMD من عملية توصيل الأدوية المطولة عن طريق التسريب13. سيكون من المستحيل إجراء حقن جرعة واحدة متكررة باستخدام نظام المضخة التناضحية. لا توجد طريقة سهلة لطرد السائل المحاصر المتبقي بعد كل حقنة. وتقتصر المضخة التناضحية أيضا على تقديم خليط من الأدوية المتوافقة أو الفردية وعادة ما تتطلب كميات أكبر من إعداد الأدوية للتسريب المستمر. في المقابل، تم تصميم مورين أومايا للحقن الدقيقة الدقيقة التي لا يصل 3 إلى 7 ميكرولتر، دون الحاجة إلى حساب المساحة الميتة، وليس هناك قيود على نوع الأدوية التي يمكن للباحثين استخدامها، بما في ذلك العلاج بالخلايا المناعية. كما يقلل مورين أومايا من نفايات الكاشف إذا كانت عينة معينة ثمينة ويزيد من استخدام هذا المورد. بالنسبة لأي نظام علاجي يتطلب جرعات متعددة من العلاجات المضادة للسرطان ، فإن Murine Ommaya سهل الاستخدام ، وهناك الحد الأدنى من خطر العدوى أو المغامرة الجراحية ، مع النهج البديلة للوصول المتكرر إلى CSF جراحيا أو عن طريق الولادة المتكررة بإبرة. يوفر مورين أومايا للباحثين المرونة لضبط تركيزات الأدوية وترددات التعاطي وتقييم التشكيل المستهدف ومدة الدراسة وفقا لبحث الاهتمام.
أحد قيود مورين أومايا هو أن الباحثين قد يجدون صعوبة في زرع الجهاز في فئران أصغر. وبالتالي ، فمن الأفضل استخدام الفئران التي لا تقل أعمارهم عن 8 إلى 10 أسابيع. من الممكن أن يخرج مورين أومايا أثناء تجربة العلاج إذا لم يتم تأمين الجهاز على الجمجمة أثناء خطوات الزرع ويزول الغراء ، أو إذا كانت الفئران قد عبثت به بشكل جلخ. يحدث السيناريو الأخير بشكل أكثر تكرارا عندما تم إيواء فئران متعددة في نفس القفص. ومن ثم، فمن المستحسن أن إيواء ما لا يزيد عن اثنين من الفئران مورين أومايا زرع في قفص لمدة الجدول الزمني للعلاج. تم تعديل هذا البروتوكول لتطبيق لاصق معقم سيانواكريلات على المتباعد ، والذي وجد أنه الغراء الأكثر فعالية للحفاظ على المتباعد إلى سطح الجمجمة ومنع مورين أومايا من الخروج. وأظهرت النتائج أن الفئران LMD استفادت من العلاج المباشر داخل الثكال عن طريق أومايا مورين، مع زيادة البقاء على قيد الحياة عموما. ويمكن إعطاء أحجام ميكرولتر واحد بأمان، متجاوزا BBB، وبالتالي تقليل كمية إعداد المخدرات. والأهم من ذلك، ظلت الفئران التي شفيت من انبثاث الجهاز العصبي المركزي من دراسة العلاج المناعي Her2-antibody صحية.
يهدف التعاون مع الشركة المصنعة إلى تطوير نسخة متوافقة مع التصوير بالرنين المغناطيسي من مورين أومايا لنموذج PDX من LMD. لأن هذا الإصدار النموذج يحتوي على فاصل أدرجت، لا يلزم التجمع، مما يسمح للحفاظ على أفضل للجمجمة. أحد قيود هذا النموذج الأولي هو أنه على الرغم من أن الجهاز متوافق مع التصوير بالرنين المغناطيسي ، إلا أنه يولد ظلا يتم فيه إدخال الجهاز ، مما يقلل من رؤية الصورة لتحليلات القياس الكمي. النسخة المتوافقة مع التصوير بالرنين المغناطيسي هي أداة بديلة جيدة عندما يكون أخذ العينات من الجسم الحي السابق للجنة مكافحة الإرهاب عاملا مقيدا ، والخلايا التي تسبقها غير مجدية. مزيج من نموذج Xenograft LMD وتقنية مورين أومايا مفيد لدراسة فعالية الأدوية المستهدفة مباشرة تجاوز BBB. نتائج هذه الدراسات في الجسم الحي هي ذات الصلة سريريا لتصميم استراتيجيات علاجية عقلانية للمرضى الذين يعانون من LMD.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نود أن نشكر ميشيل ل. دانيلسون، تريشيا تفضل واتسون، وبقية فريق الطب المقارن في جامعة جنوب فلوريدا لدعمهم التقني والحفاظ على حيواناتنا. نشكر مختبرات Instech على جهودهم في العمل معنا بناء على طلبنا لتطوير مورين أومايا المتوافقة مع التصوير بالرنين المغناطيسي. ويدعم هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة (NIH) R21 CA216756 (إلى K.S.M. سمولي)، وزارة الدفاع (DOD) W81XWH1910675 (إلى B. Czerniecki وP. Kalinski)، وجوائز مركز موفيت للسرطان CBMM المبتكرة (إلى P. Forsyth و D. Duckett). وقدم المساعدة التحريرية مكتب الكتابة العلمية التابع لمركز موفيت للسرطان الدكتور بول فليتشر ودالي دراكر. ولم يقدم أي تعويض يتجاوز مرتباتهم العادية.
Materials
| 1 mm spacer disc | Alzet, Durect Corporation | #0008670 | Spacer disc only |
| 4-0 ethilon nylon suture | Any vendor | n/a | |
| Automatic syringe pumps | Harvard Syringe Pumps (or any vendor) | #70-4505 | Pump 11 Elite |
| Bead sterilizer | Braintree Scientific Inc. (or any vendor) | #GER 5287-120V | Germinator 500 |
| Buprenorphine Sustained-Release (Bup-SR) | Zoopharm | DEA controlled | |
| Cyanoacrylate sterile adhesive | Any vendor | ||
| Gas inhalation anestehsia system | VeteEquip | #901812 | COMPAC5 |
| Hamilton microliter syringes | Hamilton | 10, 25, 50, and 100 μL | 30 G for cisterna magna injection |
| Hydrogen peroxide | Any vendor | n/a | |
| IVIS 200 imaging system | Caliper Life Sciences | n/a | |
| Magnifying glass with light | Any vendor | n/a | |
| Microdrill | Stoelting (or any vendor) | #51555M | |
| MRI imaging | Bruker | BioSpec series | Optional |
| Murine Ommaya (MRI-compatible) prototype | Instech Laboratories, Inc. | #VAB620-25MRI-3.3 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Any vendor | n/a | 0.1 mm Sterile-Filtered |
| PinPort injector | Instech Laboratories, Inc. | #PNP3M-50 | |
| PinPort | Instech Laboratories, Inc. | #1-PNP3F28-50 | |
| Rodent Surgical Instruments (Scissors, Forceps) | Roboz Surgical Instrument (or any vendor) | ||
| Stereotaxic device | Stoelting (or any vendor) | #51730M | |
| Sterile blue paper/ drape covering | Any vendor | n/a | n/a |
| Sterile cotton sticks | Any vendor | n/a |
References
- Chamberlain, M. C. Leptomeningeal metastasis. Current Opinion in Neurology. 22 (6), 665-674 (2009).
- Nayar, G., et al. Leptomeningeal disease: current diagnostic and therapeutic strategies. Oncotarget. 8 (42), 73312-73328 (2017).
- Shapiro, W. R., Johanson, C. E., Boogerd, W. Treatment modalities for leptomeningeal metastases. Seminars in Oncology. 36 (4), 46-54 (2009).
- Davies, M. A., et al. Prognostic factors for survival in melanoma patients with brain metastases. Cancer. 117 (8), 1687-1696 (2011).
- Znidaric, T., et al. Breast cancer patients with brain metastases or leptomeningeal disease: 10-year results of a national cohort with validation of prognostic indexes. Breast Journal. 25 (6), 1117-1125 (2019).
- Glitza, I. C., et al. Leptomeningeal disease in melanoma patients: An update to treatment, challenges, and future directions. Pigment Cell & Melanoma Research. 33 (4), 527-541 (2020).
- Raizer, J. J., et al. Brain and leptomeningeal metastases from cutaneous melanoma: survival outcomes based on clinical features. Neuro-oncology. 10 (2), 199-207 (2008).
- Taillibert, S., et al. Leptomeningeal metastases from solid malignancy: a review. Journal of Neurooncology. 75 (1), 85-99 (2005).
- DeVos, S. L., Miller, T. M. Direct intraventricular delivery of drugs to the rodent central nervous system. Journal of Visualized Experiments. (75), e50326 (2013).
- Kodumudi, K. N., et al. Sequential anti-PD1 therapy following dendritic cell vaccination improves survival in a HER2 mammary carcinoma model and identifies a critical role for CD4 T cells in mediating the response. Frontiers in Immunology. 10, 1939 (2019).
- Dunn, L., et al. Murine model of wound healing. Journal of Visualized Experiments. (75), e50265 (2013).
- Simon, M. J., Iliff, J. J. Regulation of cerebrospinal fluid (CSF) flow in neurodegenerative, neurovascular and neuroinflammatory disease. Biochimica et Biophysica Acta. 1862 (3), 442-451 (2016).
- Shackleford, G. M., et al. Continuous and bolus intraventricular topotecan prolong survival in a mouse model of leptomeningeal medulloblastoma. PLoS One. 14 (1), 0206394 (2019).
