Un modèle murin de xénogreffe d’Ommaya pour étudier le traitement ciblé direct de la maladie leptoméningée

Le protocole a été approuvé par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux de l’Université de Floride du Sud (IS00005974). 1. Injection de CTCC dans CSF pour générer un modèle LMD de souris Préparation des CTCC Calculer le nombre de CCC nécessaires à l’injection et préparer une suspension monocellulaire à 1,0 × 104 cellules/μL dans une solution saline stérile tamponnée au phosphate (PBS). Placez la suspension cellulaire sur de la glace ou à 4 °C tout au long de la procédure.REMARQUE: Lorsque vous utilisez des lignées cellulaires nécessitant une trypsinisation, assurez-vous de laver les cellules deux fois avec du PBS stérile pour éliminer la trypsine. Effectuez le comptage cellulaire à l’aide d’un hémocytomètre ou d’un compteur cellulaire automatisé. Si une grande cohorte (>50 souris) est utilisée, recomptez les cellules et validez la viabilité cellulaire entre les injections pour vous assurer qu’un nombre constant de cellules sont administrées par souris. Procédure préchirurgicale Injecter à la souris par voie sous-cutanée 1 mg/kg de buprénorphine à libération prolongée (Bup-SR).REMARQUE: Ne pas injecter la zone d’incision proposée; choisissez un site d’injection bien éloigné de l’omoplate. Anesthésiez la souris avec 2-3% d’isoflurane jusqu’à ce qu’elle ne montre aucun signe du réflexe de redressement. De plus, vérifiez le réflexe de pincement de la queue et / ou de la patte pour confirmer l’état d’anesthésie. Préparez la souris pour la chirurgie dans un endroit éloigné de la zone d’opération. Couper le site chirurgical (c.-à-d. la surface dorsale du crâne) avec suffisamment de bordure pour empêcher la fourrure de contaminer le site d’incision; ensuite, saturez le site avec un antiseptique cutané germicide, en travaillant du centre du site à la périphérie, puis laissez sécher. Appliquez un drapé stérile ou un drapé en plastique stérile à dos adhésif pour protéger le site chirurgical de la contamination.REMARQUE: Les instruments doivent être autoclavés à l’avance et les pointes stérilisées à nouveau entre les animaux à l’aide d’un stérilisateur de perles de verre. Rasez la fourrure de toute la surface ventrale de la tête et préparez la peau en utilisant une technique stérile. Situez le nez avec un cône de nez modifié en forme de L de l’appareil stéréotaxique, en veillant à ce que les narines restent claires et ouvertes. À l’aide de ruban adhésif sur les surfaces ventrales des deux pennes, tirez doucement la peau vers l’avant pour la fixer au cône du nez et pliez le cou à un angle d’environ 90 ° une fois fixé. Administrer 1,5 % d’isoflurane pour maintenir l’anesthésie.REMARQUE: Un bon positionnement entraînera la présentation de la zone d’incision d’une manière qui permet d’identifier facilement la crête caudale de l’os occipital. Positionnez le corps pour vous assurer que la colonne vertébrale est maintenue au niveau de la cisterna magna et, tout en appliquant une légère traction sur la queue, placez du ruban adhésif à la base de la queue pour la sécuriser. Injection chirurgicale de cisterna magna Avec le cou en pleine extension, et en commençant juste entre les pennes, faites couler les pointes de ciseaux chirurgicaux vers le bas avec une légère pression sur l’os occipital.REMARQUE: Dans cette position médiane, une petite dépression est perceptible lorsque les pointes de ciseaux plongent dans la zone concave au-dessus de la cisterna magna. Faites une petite incision médiane de 3 à 5 mm juste au-dessus de la concavité palpée. Aspirer 5 μL de suspension cellulaire à 1,0 × 104 cellules/μL (total 5,0 × 104 cellules) dans une seringue Hamilton de 30 G. Utilisez des pinces à pointe émoussée avec des pointes de 1 à 2 mm pour appuyer doucement sur la cisterna magna. Introduisez des embouts en position fermée et ouvrez-les tout en appliquant une pression vers le bas sur la dura. Répétez la dissection contondante décrite à l’étape précédente jusqu’à ce que la membrane durale soit facilement identifiée et que les vaisseaux sanguins associés soient visibles dans la zone exposée.REMARQUE: La fenêtre d’injection résultante garantit que les vaisseaux sanguins ne sont pas endommagés lors de l’insertion de l’aiguille. Tout en maintenant la pince ouverte pour rétracter la musculature environnante, introduisez une aiguille non carottante de 30 G sous la dura pour visualiser le biseau. Assurez-vous que l’aiguille n’est introduite que juste au-delà du biseau lui-même. Déployez lentement un piston de seringue et délivrez des cellules juste en dessous de la dura. Placez correctement le biseau pour observer l’injection sous la dura. Administrez soigneusement la technique et utilisez l’aiguille non carottée de 30 G pour éviter d’endommager la membrane et assurer une fuite minimale. Si une fuite est constatée, appliquez une légère pression avec un applicateur à pointe de coton. Fermez la peau en appliquant un clip de plaie ou une micro-goutte d’adhésif pour la peau. Une fois l’injection effectuée avec succès, laissez les souris se remettre de l’anesthésie sur une couverture chaude, en les observant continuellement jusqu’à ce qu’elles puissent maintenir la position sternale et démontrer un mouvement délibéré. Surveillez les souris quotidiennement après la chirurgie pendant la première semaine. Si une souris semble souffrir ou souffrir, traitez-la avec une injection sous-cutanée de carprofène de 10 mg / kg une fois toutes les 12 à 24 heures pendant 5 jours sur la base d’une consultation et d’une directive vétérinaires. Laissez les souris les récupérer et surveillez-les pendant au moins 48 à 72 h avant de passer à l’étape suivante.REMARQUE: Bup-SR, administré de manière préventive, durera jusqu’à 72 h, de sorte que des analgésiques supplémentaires ne sont normalement pas nécessaires. Cependant, les animaux recevront un analgésique supplémentaire si nécessaire (s’ils sont léthargiques, ne mangent pas, ébouriffés). Si un site chirurgical développe des signes d’infection postopératoire (c.-à-d. rougeur, gonflement, sensibilité, allodynie, hyperalgésie, hyperpathie ou suppuration), ou si la souris protège la zone touchée, euthanasier la souris. Si des cellules cancéreuses sont injectées avec succès dans le LCR, la LMD et la progression tumorale se développeront dans le SNC dans les 1 ou 2 semaines (selon les types de CTC ou de lignée cellulaire utilisés)(Figure 1). 2. Assemblage et implantation de Murine Ommaya Préparation de la station Désinfectez la surface de la station. Placez un revêtement bleu sur la surface et gardez à portée de main tous les outils et fournitures stérilisés indiqués à la figure 2. Procédure préchirurgicale Appliquer l’analgésie (Bup-SR) et maintenir la technique stérile décrite à la section 1.2. Implantation chirurgicale de Murine Ommaya Assemblez le dispositif d’injection Murine Ommaya à l’aide d’un port d’injection miniature de 25 G (0,51 mm de diamètre extérieur) et d’un disque d’espacement de 1 mm. Utiliser un adhésif stérile cyanoacrylate pour assurer la pénétration d’environ 2,5 mm de la canule métallique dans l’hémisphère cérébral droit(Figure 3A-C).REMARQUE: Un prototype de souris Ommaya compatible IRM a été développé dans ce laboratoire, qui a déjà les deux parties (port d’injection miniature et entretoise) imprimées en 3D ensemble en une seule unité(Figure 3D). La version à unité unique a été testée par IRM et peut faire gagner du temps en éliminant l’étape d’assemblage. Anesthésiez la souris avec 2-3% d’isoflurane jusqu’à ce qu’il n’y ait aucun signe du réflexe de redressement. De plus, vérifiez le réflexe de pincement de la queue et / ou de la patte pour confirmer l’état de l’anesthésie. Raser toute la surface ventrale de la tête de fourrure et préparer la peau selon la technique stérile, comme décrit précédemment à l’étape 1.2.3. Placez la souris dans l’appareil stéréotaxique avec un cône de nez pour continuer l’administration d’isoflurane pendant la procédure; diminuer l’isoflurane à 1,5%. Serrez doucement les barres auriculaires pour fixer la tête et appliquez du lubrifiant pour les yeux pour couvrir les yeux de la souris. Faites une petite incision cutanée (3 mm), suivie d’une dissection émoussée des tissus sous-cutanés sous-jacents pour exposer le crâne. Séchez le crâne à l’aide de bâtonnets applicateurs à pointe de coton imbibés de peroxyde d’hydrogène. Percer un trou de bavure dans le crâne de 0,5 mm postérieur et 1,1 mm latéral du bregma – le point anatomique du crâne où la suture coronale est recoupée perpendiculairement par la suture sagittale (Figure 3A) – ainsi qu’un trou de bavure de 0,9 mm pour exposer la dure-mère. Écartez le micropercille et marquez doucement l’os entourant immédiatement le trou de bavure avant d’insérer un orifice d’injection (profondeur d’environ 2,5 mm) fixé au crâne à l’aide d’un adhésif stérile au cyanoacrylate. Suture d’état autour du point d’injection à l’aide de sutures en nylon 4-0 sans absorbance dans un motif de point interrompu ou suture de cordon de bourse11. Hébergez des souris post-opératoires dans des cages individuelles pour la récupération chirurgicale.REMARQUE: Il est possible que l’Ommaya murin se détache lorsque plusieurs souris récupérées chirurgicalement sont logées dans la même cage, peut-être en raison d’interactions de falsification constantes. Il est recommandé que les souris implantées par Murine Ommaya soient logées individuellement (ou pas plus de 2 souris par cage) au cours de l’essai d’efficacité du médicament. 3. Traitement Murine Ommaya Dosage de souris à l’aide de l’Ommaya Murin Anesthésiez la souris avec 2-3% d’isoflurane, jusqu’à ce qu’il n’y ait aucun signe de réflexe de redressement. De plus, vérifiez le réflexe de pincement de la queue et / ou de la patte pour confirmer le maintien de l’anesthésie. Accédez à l’Ommaya Murin à l’aide d’un adaptateur d’injection à port et d’une seringue Hamilton. À l’aide d’une pince, maintenez le haut de l’aisselle d’injection miniature et insérez doucement l’adaptateur d’injecteur de port complètement dans le septum du port.REMARQUE: L’injecteur à bâbord perce le septum du port d’une manière qui réduit au minimum l’espace mort et permet une injection contrôlée via une pompe à seringue motorisée (Figure 4A). Les traitements ciblés/nouveaux sont injectés à un débit de 1 μL/min sous anesthésie. Le traitement doit être administré à des intervalles spécifiés (quotidien / hebdomadaire) pour une durée définie (semaines / mois), selon la discrétion du chercheur.Un volume compris entre 3 et 7 μL est optimal, car un volume 7 μL peut provoquer une pression trop importante. La taille de la seringue Hamilton peut varier de 10 à 100 μL, selon le nombre de souris dans chaque bras de traitement. Le préchargement du volume approprié dans la seringue Hamilton empêchera le remplacement répété de la seringue, minimisant ainsi les erreurs. Il est préférable de dédier 1 seringue Hamilton par bras de traitement. Une fois l’injection effectuée, détachez l’Ommaya Murin de l’adaptateur d’injection à orifice à l’aide d’une pince et ramenez la souris dans la cage pour récupérer de l’anesthésie, comme décrit ci-dessus à l’étape 1.3.7. Euthanasie Euthanasier les souris par inhalation de dioxyde de carbone (CO2)provenant d’une source de réservoir comprimé. Exposer les souris à des concentrations croissantes de CO2 (c.-à-d. un taux de déplacement de 10 % à 30 % du volume de la chambre/min doit être utilisé) pour éviter ou minimiser l’inconfort ou la détresse. Surveiller les souris jusqu’à l’assurance de l’arrêt des mouvements cardiovasculaires et respiratoires.