מודל קסנוגרפט של מורין אומאיה לחקר טיפול ישיר ממוקד במחלת לפטומינגיאל

הפרוטוקול אושר על ידי אוניברסיטת דרום פלורידה מוסדית טיפול ושימוש הוועדה (IS00005974). 1. הזרקת CTCs ל- CSF כדי ליצור דגם LMD של עכבר הכנת CTCs חשב את מספר CTCs הדרוש להזרקה, ולהכין השעיה של תא יחיד ב 1.0 × 104 תאים / μL מלוחים חוצצי פוספט סטריליים (PBS). מניחים את השעיית התא על קרח או ב 4 °C (5 °F) לאורך כל ההליך.הערה: בעת שימוש בקווי תאים הדורשים טריפסיניזציה, הקפד לשטוף תאים פעמיים עם PBS סטרילי כדי להסיר טריפסין. בצע ספירת תאים באמצעות המוציטומטר או מונה תאים אוטומטי. אם נעשה שימוש בקוהורטה גדולה (>50 עכברים), ספר מחדש את התאים ואמת את הכדאיות של התא בין זריקות כדי להבטיח שמספר עקבי של תאים מנוהלים לכל עכבר. הליך פרסוקרתי הזרק לעכבר באופן תת עורי 1 מ”ג/ק”ג בופרנורפין בשחרור מתמשך (Bup-SR).הערה: אין להזריק את אזור ההסתה המוצע; בחר אתר הזרקה הרחק משען השכם. להעשיר את העכבר עם 2-3% איזופלוראן עד שהוא לא מראה סימנים של רפלקס הימין. בנוסף, לבדוק אם יש רפלקס צביטת זנב ו/או כף רגל כדי לאשר את מצב ההרדמה. הכן את העכבר לניתוח במיקום מרוחק מאזור הניתוח. קליפ את האתר הכירורגי (כלומר, פני השטח של הגולגולת) עם מספיק אזור גבול כדי למנוע פרווה מזהם את אתר החתך; לאחר מכן, להרוות את האתר עם חיטוי עור נבט, עובד ממרכז האתר לפריפריה, ולאחר מכן לאפשר להתייבש. יש למרוח וילון סטרילי או חומר וילון פלסטיק סטרילי המגובה בדבק כדי להגן על האתר הכירורגי מפני זיהום.הערה: יש לעבוד על מכשירים באופן אוטומטי מראש וטיפים מעוקרים מחדש בין בעלי חיים באמצעות מעקר חרוזי זכוכית. לגלח את הפרווה של כל פני השטח הגחון של הראש, ולהכין את העור באמצעות טכניקה סטרילית. למקם את האף עם חרוט האף בצורת L שונה של המנגנון סטריאוטקטי, להבטיח את nares להישאר ברור ופתוח. באמצעות סרט על פני המשטחים הגחון של שני הפינה, משכו בעדינות את העור קדימה כדי לאבטח אותו לקונוס האף, וכיופפו את הצוואר בזווית של כ-90° לאחר המאובטח. תן 1.5% איזופלוראן כדי לשמור על הרדמה.הערה: מיקום נכון יגרום לכך שאזור ההחתכה יוצג באופן המאפשר זיהוי קל של הרכס העגול של העצם העורפית. מקם את הגוף כדי להבטיח את עמוד השדרה נשמר ברמה עם מגנה בור, ותוך כדי החלת משיכה קלה על הזנב, מניחים סרט בבסיס הזנב כדי לאבטח. הזרקת מגנה בור כירורגית עם הצוואר בהרחבה מלאה, ומתחיל רק בין הפינה, הפעל את קצות המספריים הניתוחיים כלפי מטה עם לחץ קל על פני העצם העורפית.הערה: בעוד בתנוחה זו באמצע הקו, דיכאון קטן מורגש כאשר קצות המספריים לטבול לתוך האזור קער מעל מגנה בור. הפוך 3-5 מ”מ קטן 3-מ”מ קו האמצע ין יתד ממש מעל קישוש חישי. צייר 5 μL של השעיית תא ב 1.0 × 104 תאים / μL (סה”כ 5.0 × 104 תאים) לתוך מזרק 30 G המילטון. השתמש במלקחיים קהים עם טיפים של 1-2 מ”מ כדי ללחוץ בעדינות על מגנה הבור. הציגו טיפים במצב סגור ופתחו אותם תוך הפעלת לחץ כלפי מטה על הדורה. חזור על ניתוח בוטה המתואר בשלב הקודם עד קרום dural מזוהה בקלות, ואת כלי הדם הקשורים נראים באזור החשוף.הערה: חלון ההזרקה המתקבל מבטיח שכלי הדם לא ניזוקו במהלך החדרת מחט. תוך החזקת המלקחיים פתוחים כדי לחזור בהם מהשרירים שמסביב, הציגו מחט 30 גרם שאינה קורינג מתחת לדורה כדי לדמיין את שיפוע. ודא המחט הוא הציג רק מעבר שיפוע עצמו. פרוס לאט בוכנה מזרק, ולספק תאים ממש מתחת דורה. מניחים כראוי את שיכול כדי לצפות בזריקה מתחת לדורה. בזהירות לנהל את הטכניקה, ולהשתמש במחט 30 G non-coring כדי למנוע נזק לממברנה ולהבטיח דליפה מינימלית. אם נודע על דליפה, יש להפעיל לחץ עדין עם אפליקטור עם קצה כותנה. סגור את העור על ידי מריחת קליפ פצע או מיקרו טיפה של דבק העור. לאחר ההזרקה מבוצעת בהצלחה, לאפשר לעכברים להתאושש מהרדמה על שמיכה חמה, התבוננות בהם ברציפות עד שהם יכולים לשמור על תנוחה בעצם ולהפגין תנועה תכליתית. פקח על העכברים מדי יום לאחר הניתוח בשבוע הראשון. אם עכבר נראה בכאב או במצוקה, לטפל בו עם 10 מ”ג / קילוגרם הזרקה תת עורית של carprofen אחת ל 12 עד 24 שעות עד 5 ימים בהתבסס על ייעוץ וטרינרי והוראה. אפשר לעכברים להתאושש ולנטר אותם לפחות 48 עד 72 שעות לפני שתמשיך לשלב הבא.הערה: Bup-SR, נתון מראש, יימשך עד 72 שעות, כך שבדרך כלל אין צורך במכאומי כפיים נוספים. עם זאת, בעלי חיים יקבלו משען נוסף לפי הצורך (אם רדומים, לא אוכלים, וולאנים). אם אתר כירורגי מפתח סימנים של זיהום לאחר הניתוח (כלומר, אדמומיות, נפיחות, רגישות, אלודיניה, היפראלגזיה, היפרפתיה או החלפה), או אם העכבר שומר על האזור הפגוע, המת תחסד את העכבר. אם תאים סרטניים מוזרקים בהצלחה ל- CSF, התקדמות LMD וגידול תתפתח במערכת החזותית בתוך שבוע או שבועיים (בהתאם לסוגי ה- CTCs או קו התא המשמשים) (איור 1). 2. הרכבה והשתלה של מורין אומאיה הכנת תחנה לחטא את פני השטח של התחנה. הניחו כיסוי כחול על פני השטח, והכנו את כל הכלים והאספקה המעוקרים המצוינים באיור 2. הליך פרסוקרתי החלת שך לשון (Bup-SR), ולשמור על טכניקה סטרילית כמתואר בסעיף 1.2. השתלה כירורגית של מורין אומאיה להרכיב את התקן הזרקת מורין Ommaya באמצעות 25 G (0.51 מ”מ קוטר חיצוני) יציאת הזרקה מיניאטורית דיסק מרווח 1 מ”מ. השתמשו בדבק סטרילי ציאנואקרילט כדי להבטיח חדירה של כ-2.5 מ”מ של צינורית המתכת לחצי הכדור הימני(איור 3A-C).הערה: אב טיפוס של עכבר אומאיה תואם MRI פותח במעבדה זו, שכבר כוללת את שני החלקים (יציאת הזרקה מיניאטורית ומרווח) מודפסים יחד כיחידה אחת(איור 3D). גירסת היחידה היחידה נבדקה על-ידי MRI ויכולה לחסוך זמן על-ידי ביטול שלב ההרכבה. להעשיר את העכבר עם 2-3% איזופלוראן עד שאין סימנים של רפלקס ימין. יתר על כן, לבדוק את הזנב ו /או כף רגל לצבוט רפלקס כדי לאשר את מצב ההרדמה. לגלח את כל פני השטח הגחון של ראש הפרווה, ולהכין את העור על פי הטכניקה סטרילית, כפי שתואר בעבר בשלב 1.2.3. מניחים את העכבר במנגנון הסטריאו-קטרקטי עם חרוט האף כדי להמשיך בניהול איזופלוראן במהלך ההליך; להקטין את האיזופלוריין ל-1.5%. הדק בעדינות את מוטות האוזן כדי לאבטח את הראש, והחיל חומר סיכה לעיניים כדי לכסות את עיני העכבר. הפוך חתך עור קטן (3 מ”מ), ואחריו ניתוח בוטה של הרקמות התת עוריות הבסיסיות כדי לחשוף את הגולגולת. יבשו את הגולגולת באמצעות מקלות אפליקטור ספוגי מי חמצן עם קצה כותנה. לקדוח חור בר בגולגולת 0.5 מ”מ אחורי ו 1.1 מ”מ לרוחב של ברגמה – הנקודה האנטומית על הגולגולת שבו התפר קורונל מצטלב בניצב על ידי תפירת sagittal (איור 3A) – כמו גם חור burr 0.9 מ”מ לחשוף את dura mater. הזז את המיקרודריל הצידה, והבקיע בעדינות את העצם המקיפה את חור הבר לפני הכנסת יציאת הזרקה (עומק של כ -2.5 מ”מ), המודבקת לגולגולת באמצעות דבק סטרילי ציאנואקרילט. תפר המדינה סביב נקודת ההזרקה באמצעות תפרי ניילון ללא ספיגה 4-0 בתבנית תפר מופרעת או תפר מחרוזת ארנק11. עכברים לאחר ניתוח בית בכלובים בודדים להחלמה ניתוח.הערה: ייתכן כי מורין Ommaya עשוי לרדת כאשר עכברים רבים התאושש ניתוח שוכנים באותו כלוב, אולי בשל אינטראקציות שיבוש מתמיד. מומלץ כי עכברים מושתלים מורין Ommaya שוכנים בנפרד (או לא יותר מ 2 עכברים לכלוב) במהלך הניסוי יעילות התרופה. 3. טיפול מורין אומאיה עכברים מנונים באמצעות מורין אומאיה למרדים את העכבר עם 2-3% איזופלוראן, עד שאין סימנים של רפלקס ימין. יתר על כן, לבדוק את הזנב ו /או כף רגל לצבוט רפלקס כדי לאשר תחזוקה של הרדמה. גש למורין אומאיה באמצעות מתאם הזרקת יציאה ומזרק המילטון. באמצעות מלקחיים, החזק את החלק העליון של יציאת הזרקה מיניאטורית ולהכניס בעדינות את מתאם מזרק היציאה באופן מלא לתוך המחיצה של הנמל.הערה: מזרק היציאה חודר את המחיצה של הנמל באופן שמצמצם את שטח המת למינימום ומאפשר הזרקה מבוקרת באמצעות משאבת מזרק ממונעת (איור 4A). טיפולים ממוקדים/חדשניים מוזרקים בקצב זרימה של 1 μL / min בזמן הרדמה. הטיפול יינתן במרווחי זמן מוגדרים (יומיים/שבועיים) למשך זמן מוגדר (שבועות/חודשים), בהתאם לשיקול דעתו של החוקר.אמצעי אחסון בין 3 ל- 7 μL הוא אופטימלי, מכיוון שנפח 7 μL עלול לגרום ללחץ רב מדי. גודל מזרק המילטון יכול לנוע בין 10 ל 100 μL, בהתאם למספר העכברים בכל זרוע טיפול. טעינה מראש של הנפח המתאים למזרק המילטון תמנע החלפה חוזרת ונשנית של המזרק, ובכך תמזער שגיאות. עדיף להקדיש מזרק המילטון אחד לכל זרוע טיפול. לאחר ההזרקה נעשית, לנתק את מורין Ommaya ממתאם הזרקת הנמל באמצעות מלקחיים, ולהחזיר את העכבר לכלוב להתאושש הרדמה, כפי שתואר לעיל בשלב 1.3.7. המתת חסד להרדים את העכברים על ידי שאיפת פחמן דו חמצני (CO2) ממקור טנק דחוס. לחשוף את העכברים לריכוזים הולכים וגדלים של CO2 (כלומר, שיעור עקירה מ 10% עד 30% של נפח החדר / דקה הוא לשמש) כדי למנוע או למזער אי נוחות או מצוקה. נטר את העכברים עד להבטחה של הפסקת תנועות לב וכלי דם ונשימה.