キャビテーション強化療法の研究

1. システム設計原則 注: このセクションでは、米国の露出およびキャビテーション監視用のシステムを作成するために使用される設計原則を示します。これらの原則は、音響トランスフェクション(SAT)用の既存の2つのシステム( 図1を参照)で示されています。各システムは、セル露出コンパートメント、米国のソース、および受動キャビテーション検出器(PCD)として機能する単一の要素トランスデューサで構成され、そのすべてがベンチトップ試験室に統合されています。これらの設計は、Carugoら(2015)65に記載されている以前のシステム開発に基づいて構築されます。 使いやすさを最大限に引き出します。 既存の市販の細胞培養デバイスを播種/増殖基材として使用することにより、既存の培養技術やイメージングシステムと相性の高い細胞暴露コンパートメントを作ります。 SAT2の場合は、培養皿(直径35mm、直径21mmの面積が観察可能)を使用して、 材料表を参照してください。 SAT3 の場合は、トランスウェル挿入物を使用します(直径 6.5 mm、 表を参照)。トランスウェルズは透過性膜を有するため、水ではなく細胞培地に入れなければなりません。 セル露出コンパートメントの迅速なローディングとシールを可能にします。 培養皿の上に柔軟なポリマー蓋を取り付けてSAT2細胞露光コンパートメントを形成する(Carugo et al. 201565)。図1Cに見られるように、蓋には直径1.2mmの穴があり、コンパートメントに18Gの鈍い針の注射器を充填することができます。充填後、これらの充填ポートを短いプラスチック棒(材料表)で密封してください。 SAT3コンパートメントをシリンジまたはピペットで充填し、ゴム栓/バンを押し付け、シールします。 試験室への密閉された細胞露出のコンパートメントの急速なローディングを可能にする。セル露出コンパートメント用のホルダーは、適切な位置合わせを確保するために軽いプレスフィットで十分であるチャンバーの蓋に組み込まれました。 図 1に示すシステムでは、複数のセルエクスポージャーコンパートメントが事前に用意されている場合、サンプルの変更時間は 20 秒ほど短くなります。 システムがポータブルであり、必要な水/媒体の量を最小限に抑えることができるように、チャンバー内部の容積を最小限に抑えます。そうすることで、細胞暴露コンパートメントからの偶発的な流出やキャビテーション剤の漏出からの回復も加速します。注: SAT2 内部ボリュームは約 0.8 L です。SAT3の内部容積はおよそ7.6 Lである– 容易なローディングおよびソーストランスデューサーまたはその構成の変更に対応するために大きくなった。0.3 Lの内部チャンバーを加えて、使い捨て体積を最小限に抑え、タンク充填水(例えば細胞培養媒体)以外の生物学的に関連する液体を使用できるようにした。内部の部屋の底は最大の音響伝達を可能にするために30のμm厚いマイラーシートからなされる。 可能な場合は、チャンバーと内部コンポーネントを光学的に透明な材料から取り出し、問題(例えば、漏れ、閉じ込められたマクロバブル)を迅速に観察し、改善することができるようにします。 露出コンパートメントの音響透過性を最大化します。 コンパートメントの壁材と厚みの選択によって透過性を最大化します。壁の両側の液体が本質的に同じであるという仮定(例えば、水)の下で、通常の入射圧力伝達係数71 の大きさは次のとおりです。ここで、λは厚さL、z Lおよびzoの壁の波長であり、それぞれ壁材と液体の特性インピーダンス(密度と音速の積)である。T = 1 は、完全な伝送を示します。 キャビテーションの広域スペクトルモニタリング(例えば、1〜8MHz)では、ほとんどの実験用ポリマー(例えば、PDMS、PTFE、ポリスチレン)は、材料の厚さが材料の波長の1/10分の1より 小さい場合、10%以下で透過圧力を変えます。この条件は、高周波数(例えば、8 MHzで#1.5カバースリップ)で標準的な電源を満たすことが困難な場合があるため、伝送周波数応答を予測または直接較正することをお勧めします。 米国のソース信号をセル露光コンパートメントに狭帯域伝送する場合、層材料内の半波長の倍数の整数である場合は、より厚い層を可能にする。例えば、SAT2のPDMS蓋は、厚さ2.0mm(1MHzでは〜2波長、cPDMS~1000 m/s)で使用される。 ソースとセル環境の選択により、露出領域を最大化します。 露出した細胞の数を最大化するには、利用可能な培養およびイメージング装置との互換性を維持しながら、細胞の取り付け面積を可能な限り広くします。 大きな焦点を合わせるソース(SAT2)の事前焦点領域またはセルアタッチメント領域の直径に一致する主葉幅を持つ焦点またはレンズソースを使用して、空間変動を最小限に抑えてセル接続領域にまたがるフィールドを持つ米国ソースを使用します(SAT3)。特定のソースについては、 材料表 を参照してください。 入射フィールドの最も強い部分から離れた場所でセルコンパートメントを機械的に支え、ホルダーの散乱断面を最小限に抑えたり、ホルダーに吸収材料を配置したりすることで、セルコンパートメントホルダによってもたらされるフィールドの複雑さを最小限に抑えます。例は図 1A および 図 1Dに示されています。 繰り返し露光条件を確認します。 部分的に満たされたチャンバ内の空気と水の界面から生じる変動性を排除するために、固定境界内の音響場を終了します。SAT2および3では、これは、境界反射から生じる可能性のあるフィールドの複雑さを軽減するというさらなる利点を持つチャンバー蓋に音響吸収器( 材料表を参照)を設置することによって達成される。 小さな変動や大きな誤動作を素早く検出できるように、アンプ出力/ソース入力でソース駆動電圧を監視および記録します。目的の駆動電圧範囲を超えて安全に使用できる電圧プローブまたはその他のデバイスを使用します。波形発生器などの既知のソースを用いて、電圧プローブのキャリブレーションを定期的にチェックします。 チャンバの温度とその内容を制御、監視、および記録します。細胞、トランスデューサ、および伝搬媒体の応答は、すべて温度感受性であり得る。SAT2では、監視と制御は、水の調整システムに接続された循環ポートのペアで達成され、SAT3は、(図示せず)、水族館ヒーターを採用しています。必要に応じて水温を設定して、治療用途に関連する生理学的条件を模倣します。注: 内部温度は、外部要因の結果として、およびトランスデューサおよび媒体の米国で生成された加熱の結果として変化する可能性があります。 チャンバー液体を慎重に脱気して、伝搬経路内の既存の気泡から意図しないキャビテーションや散乱の可能性を最小限に抑えます。注:脱ガスが行われなかった場合、例えば細胞への悪影響のために、適切なバブル活動の背景レベルが高くなります。 完全に組み立てられたシステムを調整します。 細胞露出コンパートメントを含め、すべてのシステムコンポーネントが所定の位置にあるときに、露出した細胞に入射する圧力場を測定する手段を含む。SAT2および3では、これは測定される分野を妨げることなく針または光ファイバーハイドロフォンを挿入することができるチャンバー蓋の開口部で達成される。セルが配置されている場所にできるだけ近い値を測定します。 敏感な半径(rcv)が測定される圧力フィールドを誤って報告しないほど小さいハイドロフォンを選択してください。許容サイズは、ソース周波数(f)と半径(src)の関数と、ソースとフィールドスキャンの間の距離(zrcv)です。ハイドロフォンサイズ選択の一般的な基準は: に導きます: cは音速72です。 セクション 1.6 で指定された温度を含め、システム特性評価に使用される条件の下でハイドロフォンが較正されていることを確認します。具体的には、ハイドロフォンがスキャン面に対して角度で保持されている場合、ダイレクト性効果は純粋に幾何学に基づいて予想されるものと大きく異なる可能性があるため、ハイドロフォンはその角度で較正されなければならない。温度に関するハイドロフォン感度の変化は、メーカーから入手可能である必要があります。 セルが露出する領域全体をスキャンします。適切なレベルのフィールドディテールをキャプチャするには、対象となる最高周波数の波長の 1/5分 の 1 よりも粗いスキャン間隔を使用します。予期しないフィールドの複雑さが観察される場合は、短いバースト信号(例えば、1~3サイクル)を使用して、直接的なフィールド寄与と散乱フィールド寄与の特定と定量化を可能にすることを検討してください。 キャビテーション監視機能を組み込みます。 システム全体の設計の一部として、システム全体の設計の一部として監視トランスデューサのタイプと配置を決定します。実際には、重要なシステムコンポーネントを確実に整列する能力を犠牲にすることなく、最大限にコンパクトなシステムを実現します。 キャビテーション監視装置をシステムに配置し、最小限の段取り時間やワークフローの妨害を繰り返し配置できます。SAT2では、これはチャンバリッドに取り付けられたPCDとして機能する単一の要素圧電トランスデューサで達成され、SAT3は90°反射器を使用してPCDをソースベースに統合します。 実験の目的に応じてPCD形状を選択します。 図2では、非焦点(左)デバイスと焦点を合わせられていない(右)デバイスの半振幅輪郭の計算は、周波数に関する空間感度の大きな違いを示しています。焦点を合わせられていないデバイスは、周波数に関しては適度な空間変動を伴う大音量監視に適していますが、焦点を合わせたデバイスは、対象周波数でより放射状にコンパクトな測定に適しています。 実験のニーズに合わせて、PCDの中心周波数と帯域幅を選択します。中心周波数は、通常、直接のソース放出に対する感度を最小限に抑えるために、米国のソースの少なくとも5倍に選択されます。帯域幅は、一般に、広範囲のバブル動作(高調波およびブロードバンドノイズ)を観察するために最大化されます。 次のセクションで説明するように、キャビテーション データの分析を可能にするコンディショニング、記録、および処理方法を選択します。 2. キャビテーションモニタリングのための計測と処理 注: このセクションでは、キャビテーション監視データの収集に推奨される信号フローコンポーネントと機能、およびキャビテーションアクティビティの定性的および定量的評価につながるデータ処理について説明します。 インストルメンテーション ( 図 3も参照してください)。 アプリケーションがカスタマイズされたデバイスを必要としない限り、市販の単一要素トランスデューサの広い範囲からPCDを選択し、通常、水没したターゲットの非破壊試験のために販売される。これらのサプライヤーには、ケーブル配線とアクセサリ(例えば、SAT3のミラーリフレクター)もあります。 米国のソースに対する PCD 応答を最小限に抑えます。これは、PCD(中心周波数と帯域幅)の選択とノッチまたはハイパスフィルタの使用の両方で行うことができます。後者は、スタンドアロン モジュールとして、または信号調節デバイスの一部として実装できます。 大きなダイナミックレンジ(少なくとも12ビット)のデジタイザを使用して、最小信号の高い信号クリッピングと最大信号対雑音比(SNR)の可能性を最小限に抑えて、できるだけ多くのデータをキャプチャします。デバイスを比較する場合、信号とノイズの仕様、ノイズの歪み、および/または有効なビット数を確認します。また、メモリ バッファのサイズが、データ キャプチャの目的の長さと速度に十分かどうかを検討します。 デジタイザーのダイナミックレンジの使用を最適化します。PCD信号は、(気泡が除去される)長時間の露出と、様々な米国のドライブレベルで実験を実行している場合の両方のために、いくつかの桁をカバーすることができます。したがって、シグナルコンディショニングチェーンがすべての信号を適切に記録できるようにスケーリングすることを確認する必要があります。 信号チェーンにプリアンプを含めるため、予想される最小の信号を適切にキャプチャできます。私たちの経験では、PCD自己ノイズはほとんどのデジタイザーのそれより大きく低いので、適度な予水率(例えば、<100x)は、最終的な結果のSNRを改善することができます。 増幅器を飽和させないために、事前増幅の前に米国のソース周波数をフィルタリングします。 米国のパルサー/レシーバを使用してゲインおよび/またはフィルタリング機能を提供する場合は、パルサーモードでパスの長さ/位置合わせを確認するか、PCDとセルエクスポージャーコンパートメント間の伝搬経路で予期しない散乱を確認します。 ストレージへのデータのリアルタイムストリーミングを有効にします。SAT2 と SAT3 の両方のシステムは、移植性と適切に構築されたユーザー インターフェイスの利便性を持つ 12 ビット ストリーミング USB オシロ スコープ ( 資料表を参照) を採用しています。 ゲインまたは帯域幅のエラーを避けるために、信号チェーン内の適切なインピーダンスマッチングを確認します。PCDデバイスは通常、50オーム付近の出力インピーダンスを持つため、PCDを波形発生器からの既知の信号(50オーム出力インピーダンス)に置き換え、デジタイザに表示される信号サイズが期待に一致することを確認し、注入された信号が変更されたときに直線的にスケーリングし、関心のある最大の信号に対してクリッピングが観察されない。 前処理 対象の周波数範囲でのデータの処理に関連する信号経路内のすべての既知のゲインと感度の生電圧信号を修正します。 データが DC 入力カップリングで記録されたか、DC オフセットを示している場合は、直接減算または高パス フィルターを使用してこのオフセットを削除します。 各記録信号のパワースペクトル P を計算します。 米国のソースf0の基本周波数が変換ビン幅の大きな整数倍になるようにフーリエ変換長Nftを設定します: Nft =   nfs/f0、nは整数、fsはデジタル化されたデータのサンプル周波数です。 スペクトルフィーチャを明確にキャプチャするためにn ≥ 50 を設定します。50 MHz でサンプリングされた 1 MHz の基本サンプルの例では、Nftは 2500、ビン幅は 0.02 MHz です。 変換長のNftは通常、記録された信号の持続時間よりも小さいので、ウェルチの方法73のようなパワースペクトル密度(PSD)推定器を使用する。周波数帯の f1-f2をスパンする電力は 、dFは変換ビン幅です。 各露出の間に気泡活動を特徴付けるには 、f0(高調波)の整数倍 、f0/2(超高調波)の奇数倍数、および広帯域ノイズ(慣性キャビテーション)から電力スペクトルへの寄与を推定する。 高調波および超高調波含有量は、特定の周波数でのパワースペクトル値を選択することで、最も単純に推定されます。しかし、大きな振幅の音色応答は、隣接する少数の周波数ビン(例えば、f0 ± 2-3)に広がる可能性があるため、これらは狭帯域電力計算に含まれ、広帯域計算から除外されるべきである。 全電力スペクトルからの高調波および超調和寄与の減算により広帯域バンドキャビテーション電力を推定する。あるいは、これらの寄与度は、より高度な前処理74を用いて推定することができる。 曝露の持続時間にわたる累積キャビテーション信号エネルギーを推定し、好ましくはスペクトル特徴/気泡活性タイプに従う。 すべてのデータ レコードの継続時間が等しいと仮定すると、記録されたデータの累積エネルギーは 、 Mはレコード数を示します。 露出が連続している場合に発生する可能性があり、保存されたファイルが総露出時間 Teの一部をキャプチャする場合、記録間にギャップがある場合、累積エネルギーは次のように推定されます。 米国の不在時に記録されたバックグラウンドノイズのスペクトルレベルとを比較して、測定SNRを推定します。 3. 実験プロトコル サット準備 充填液(通常はろ過水)を-105 Paの圧力下で少なくとも2時間脱気することにより、伝搬経路におけるキャビテーションの可能性を最小限に抑える。酸素の分圧が10kPa以下であることを溶存酸素プローブで確認することが推奨されます。 試験室をゆっくりと充填して、脱気液への空気の再導入を最小限に抑えます。必要に応じて、充填されたチャンバーの脱気を続けます。 充填直後と露光実験を開始する直前に、トランスデューサとメディア容器表面からすべての残留気泡をクリアします。 暴露実験を開始する前に、チャンバーの温度とその内容物が安定していることを確認してください。 米国の電源パワーアンプが(メーカーの推奨ごとに)ウォームアップして、ゲインと出力が時間に対して安定するようにします。 露出コンパートメントの準備 キャビテーション剤懸濁液 キャビテーション剤を希釈する場合、マクロバブルを包み込んだり、薬剤を破壊したりすることなく、穏やかにかつ継続的に攪拌して均一な懸濁液を作ります(特に殻付き気泡の場合)。 MB を使用する場合は、読み込みプロセス75の間に破壊を最小限に抑えるために利用可能な最大のゲージ針を使用してゆっくりと撤退し、分配します。18 G鈍充満針はSATシステムと定期的に使用されている。 SAT2 準備 生細胞の実験で使用する前にPDMSのふたを殺菌する。 PDMS蓋を培養皿に合わせてプレスにより細胞露光コンパートメントを形成する。 18Gの鈍い針で注射器を準備し、液体の約10 mL(例えば、MB懸濁液または水制御)で満たします。 PDMSの穴の1つを通して針を挿入し、ゆっくりとチャンバーを満たし、マクロバブルが開いた穴を通って逃げることができるように傾けます。最良の結果を得るには、開いた穴が充填孔の上になるようにチャンバーを傾けます。 充填したら、短い(4-5 mm)ポリマーロッドを挿入して開いた穴を閉じます。両方の穴が水平になるようにアセンブリを設定します。 空気が引き込まれないように余分な液体を注入しながら鈍い充填針を取り除きます。別のポリマーロッドで穴を閉じます。このプロセスは細胞露出のコンパートメントのシールを完了する。 囲み込みマクロバブルの証拠をコンパートメントで視覚的に確認し、見つかった場合は 3.3.3.-3.3.6 を繰り返します。 コンパートメントホルダーのセル露出コンパートメントを押します。チャンバーの蓋をチャンバーの上に設置します。水平に角度で蓋を下げると、マクロバブルが水没した部分(吸収体、ホルダー)に置かないようにします。 細胞暴露コンパートメント(例えば、浮遊気泡または沈むナノ粒子)の向きを決定する際の懸濁液中の粒子の浮力と、これが細胞との接触にどのように影響するかを考慮してください。 すべての操作において、細胞の成長表面および剥離の屈曲を最小にするためにできるだけ少ない力を使用する。 SAT3 準備 トランスウェルに約150 μLの液体(例えば、MBの懸濁液または水の制御)を充填します。 慎重にゴム製プラグでトランスウェルを密封し、きれいなペーパータオルまたはワイプでオーバーフロー液体を除去することによって、セル露出コンパートメントを形成します。生きた細胞の実験で使用する前に、ゴム栓を殺菌する。 囲まれているマクロバブルの証拠をコンパートメントを視覚的に確認し、もし見つかった場合は、プラグを取り外し、マクロバブルを取り外し、4.4.2を繰り返します。 コンパートメントホルダーのセル露出コンパートメントを押します。チャンバーの蓋をチャンバーの上に設置します。水平に角度で蓋を下げると、マクロバブルが水没した部分(吸収体、ホルダー)に置かないようにします。注: 前述のように、マクロバブルは米国の暴露実験に対して、再現不可能な、潜在的に有害な影響を引き起こす可能性があります。最も重要なのは、細胞暴露コンパートメントに閉じ込められたマクロバブルが、意図した治療の代表ではないPCD応答および局所細胞の生物効果を引き起こす可能性がある。米国の実験を開始する前に、すべてのシステムコンポーネントを常に目視で調べて、マクロバブルを見つけて除去してください。 4. データ収集 制御液(例えば、脱気水または細胞媒体)で満たされた細胞暴露コンパートメントで初期実験を行うことによって、バックグラウンドPCD応答レベルを確立する。 バックグラウンドの電子ノイズレベルを確立するために、米国のソースを駆動せずにPCDデータを記録します。 計画されたドライブレベルの全範囲で米国のソースを駆動しながらPCDデータを記録します。このデータは、音響応答のどの部分が、その後テストされるキャビテーション剤と無関係であるかを示します。注: 一般的な実験室の液体(例えば、PBSまたは細胞媒体)は、脱気しない場合、適度な圧力(例えば0.5 MHzで0.5 MPa)でキャビテーションを示します。 測定を開始する前に、懸濁液がチャンバー温度と熱的に平衡化する時間を与える。細かい針熱電対は、この目的のために有用である可能性があります。 時間領域と周波数領域の両方でリアルタイムで実験を監視します。 PCDのタイムドメインモニタリングは、信号が現在の計測設定に適しているかどうかを明らかにします。具体的には、信号クリッピングは、周波数領域に多音調和応答として現れるため、避けるべきである。 PCDの時間領域モニタリングはまた、米国のソースからPCDへの暴露区画への伝搬時間に基づいてキャビテーション信号が予想よりも早く見られるかどうかを示す。そのような信号が見られる場合、これは試験室へのキャビテーション剤の漏れを示し得る。 PCDの周波数領域モニタリングは、気泡の挙動の種類を示し、所望の細胞刺激を達成するために必要に応じて駆動レベルを調整するために使用することができる(例えば、高調波励起のための低い駆動レベル)。 最初の露出が見逃されないようにするには、米国のソースドライブ信号をオンにする前にデータ収集プロセスを開始します。 実験全体を通して(波形発生器出力とは対照的に)米国のソースを駆動するアンプ出力信号を監視し、露光が期待どおりに進行していることを確認します。この測定には高電圧プローブを使用し、プローブの減衰を補正するようにオシロスコープが設定されていることを確認します。 サンプルを露出させた後、慎重に試験室から取り出します。 PDMSの蓋(SAT2)/ゴムプラグ(SAT3)を取り外し、その後の使用に備えて清掃します。 培養皿(SAT2)/トランスウェル(SAT3)を、その後の分析(例えば、顕微鏡、蛍光イメージング)のために必要に応じて移します。 少量の暴露(例えば、3-5)の後、ベースラインキャビテーション信号を再取得し(キャビテーション剤が存在しない場合)、元のデータセットと比較して、チャンバーメディアが汚染されていないかどうかを確認することをお勧めします。