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Bioengineering

Étude de la thérapie améliorée par cavitation

Published: April 09, 2021
doi:
10.3791/61989
, , ,
1Institute of Biomedical Engineering,University of Oxford

Summary

Le protocole expérimental présenté peut être utilisé pour effectuer des mesures en temps réel de l’activité de cavitation dans un dispositif de culture cellulaire dans le but de permettre l’étude des conditions requises pour une administration réussie de médicaments et / ou d’autres bioeffets.

Abstract

L’intérêt pour les applications thérapeutiques de l’échographie est important et croissant, avec des cibles cliniques potentielles allant du cancer à la maladie d’Alzheimer. La cavitation – la formation et le mouvement ultérieur de bulles dans un champ d’ultrasons – représente un phénomène clé qui sous-tend bon nombre de ces traitements. Il reste cependant une incertitude considérable concernant les mécanismes d’action détaillés par lesquels la cavitation favorise les effets thérapeutiques et il est nécessaire de développer des techniques de surveillance fiables qui peuvent être mises en œuvre cliniquement. En particulier, il existe une variation importante entre les études sur les paramètres d’exposition déclarés comme produisant avec succès des effets thérapeutiques et les émissions acoustiques correspondantes. L’objectif de cet article est de fournir des lignes directrices de conception et un protocole expérimental utilisant des composants largement disponibles pour effectuer des études sur les bioeffets médiés par la cavitation, et d’inclure une surveillance acoustique en temps réel. On espère que le protocole permettra une intégration plus généralisée de la surveillance acoustique dans les expériences échographiques thérapeutiques et facilitera la comparaison entre les études des conditions d’exposition et de leur corrélation avec les effets biologiques pertinents.

Introduction

L’échographie (US) a été largement utilisée comme technique d’imagerie diagnostique en raison de sa nature sûre et non invasive, de sa facilité de mise en œuvre au chevet d’un patient et de sa rentabilité1. En plus de ses capacités de diagnostic et de surveillance, les États-Unis ont un potentiel considérable pour des applications thérapeutiques. Les premiers travaux ont exploré son utilisation dans la thrombolyse, la transfection de l’ADN et l’administration demédicaments2,3,4 et les États-Unis thérapeutiques représentent maintenant un domaine de recherche très actif, avec des applications comprenant le traitement tumoral5,6,7,l’immunothérapie8,9,la perturbation de la barrière hémato-encéphalique (BHE)10,11,12,la thrombolyse13,14,15et le traitement des infections bactériennes16,17. Un phénomène clé qui sous-tend ces applications est la cavitation: la nucléation, la croissance et l’oscillation des cavités gazeuses dues aux changements de pression du fluide18,19.

Il existe une gamme de mécanismes par lesquels la cavitation produit des effets biologiques. Par exemple, la nature hautement non linéaire des oscillations de bulles sous l’influence d’un champ us appliqué peut générer un microstreaming dans le liquide environnant qui peut à la fois améliorer la convectionmédicamenteuse 20 et exercer des contraintes de cisaillement sur le tissu à proximité des bulles. Ceci est particulièrement répandu lorsque les bulles se trouvent à proximité d’une limite, provoquant l’oscillation non sphérique des bulles, et pouvant potentiellement favoriser l’absorption de médicaments par perméabilisation induite par cisaillement21,22,23,24. À des pressions plus élevées, on observe des oscillations de plus grande amplitude et un effondrement rapide des bulles, conférant une contrainte mécanique directe25 et générant fréquemment des ondes de choc, et donc de grands gradients de pression qui peuvent perturber et perméabiliser les tissus26,27. L’effondrement de bulles près d’une surface peut également entraîner la formation de microjets liquides à grande vitesse28,29,30. Ces microjets peuvent pénétrer dans les tissus, créant potentiellement des pores ou induisant des ondes de stress secondaires31,32. La perméabilisation des membranes biologiques tant au niveau tissulaire qu’au niveau cellulaire est diversement appelée sonophorèse, utilisée principalement dans le contexte de l’amélioration induite par les États-Unis de la perméabilité de la peau33,34,et de la sonoporation, utilisée principalement pour décrire la perméabilisation réversible de la membrane cellulaire due à la formation de pores membranaires35,36.

L’absorption visqueuse dans le liquide entourant immédiatement la bulle oscillante peut produire un effet de chauffage substantiel37. De plus, les oscillations hautement non linéaires produisent un rayonnement acoustique à des fréquences supérieures à celles du champ us de conduite. Cela conduit à une absorption accrue dans les tissus environnants et à un chauffage supplémentaire38. L’effondrement de la bulle peut également s’accompagner d’effets chimiques dus aux températures et pressions élevées transitoires dans le noyau de la bulle, tels que la génération d’espèces hautement réactives et le rayonnement électromagnétique, connu sous le nom de sonoluminescence32. Ces effets ont été étudiés pour évaluer les dommages potentiels et/ou l’activation des voies cellulaires pertinentes pour l’administration39 et exploités dans l’activation locale de médicaments sensibles à la lumière dans une approche connue sous le nom de thérapie sonodynamique40,41,42,43.

De nombreux bioeffets médiés par les États-Unis peuvent être initiés uniquement par le contrôle des paramètres de champ américains (amplitude de la pression, fréquence, longueur d’impulsion et fréquence de répétition, et durée de l’exposition), mais générer de manière fiable une cavitation dans les tissus biologiques nécessite souvent des énergies d’entrée élevées et comporte donc un risque élevé de dommages. L’introduction de noyaux de cavitation exogènes ou artificiels peut réduire considérablement l’énergie d’entrée nécessaire pour produire le large éventail d’effets discutés ci-dessus et introduit en outre des effets supplémentaires qui peuvent ne pas être possibles avec les États-Unis seuls. Les noyaux de cavitation comprennent les bulles de gaz26,44,les gouttelettes liquides45,46,47 et les particules solides48,49,50,les noyaux de cavitation à l’échelle nanométrique étant un domaine d’investigation émergent pour leurs avantages en termes de temps de circulation prolongé, d’extravasation améliorée et d’activité de cavitation prolongée49,51,52,53.

Les noyaux les plus couramment utilisés sont les microbulles gazeuses (MBs), utilisés à l’origine comme agents de contraste en imagerie diagnostique. Ils ont généralement un diamètre de 1 à 2 micromètres et contiennent un noyau de gaz de poids moléculaire élevé à faible solubilité aqueuse dans le milieu environnant. Le noyau est entouré d’une enveloppe protectrice lipidique, protéique ou polymère le plus souvent constituée de phospholipides54. Lorsqu’ils sont exposés à un champ US, la compressibilité des MBs les fait subir des oscillations volumétriques, produisant par conséquent une forte diffusion acoustique, ce qui est responsable du succès des MBs en tant qu’agent de contraste. Comme mentionné, ces oscillations conduisent également aux effets mécaniques, thermiques et chimiques susmentionnés qui peuvent être exploités dans des applications thérapeutiques. Le procédé de revêtement mb offre également un mécanisme pour encapsulant des médicaments dans la structure mb et pour attacher des médicaments et/ou cibler des espèces à la surface mb. Cette technique facilite la libération déclenchée de médicaments pour réduire la toxicité systémique55. Il a également été récemment démontré que le matériel de la surface du MB peut être transféré à des structures biologiques, améliorant l’administration de médicaments par ce qu’on appelle la « sonoimpression »56,57,58.

La surveillance de l’activité de cavitation médiée par les États-Unis peut fournir des informations sur les effets biologiques qui en résultent in vitro et in vivo et permet potentiellement le réglage et l’optimisation de ces effets. Les deux méthodes les plus largement utilisées pour surveiller l’activité de cavitation sont i) optiques, qui utilisent la microscopie vidéo à très grande vitesse et ne sont généralement pas réalisables invivo; et ii) acoustiques, qui enregistrent les champs sonores re-rayonnés produits par les bulles oscillantes et/ou qui s’effondrent. Les composantes amplitude et fréquence du signal acoustique contiennent des informations sur le comportement des bulles. Il a été démontré que de faibles concentrations de bulles à de faibles amplitudes incidentes aux États-Unis produisent principalement des émissions harmoniques (multiples entiers de la fréquence de conduite)59. À mesure que les pressions d’entraînement augmentent, le spectre d’émission de bulles peut également contenir des composants fractionnaires connus sous le nom de sous-harmoniques et d’ultraharmoniques60 qui indiquent un comportement non linéaire plus fort, ainsi que du bruit à large bande, qui indique une cavitation inertielle. Les harmoniques entières sont un indicateur primaire de l’oscillation des bulles, mais peuvent également être causées par des non-linéarités n’importe où dans un système expérimental, par exemple, en raison d’une propagation non linéaire. En revanche, les harmoniques fractionnaires et le bruit à large bande sont très fortement corrélés avec la dynamique des bulles.

La relation entre le comportement des bulles et les émissions acoustiques détectées peut être compliquée par des facteurs tels que le champ us incident, l’environnement de nucléation, et les caractéristiques de la voie de détection60. Néanmoins, des informations importantes sur le comportement des bulles et leurs interactions avec les cellules peuvent être obtenues en discernant les tendances de fréquence et d’énergie dans le spectre acoustique. Ces données peuvent également fournir des informations précieuses qui peuvent être utilisées pour former la base des techniques de surveillance du traitement clinique. Pour exploiter pleinement ces informations, le développement de méthodes expérimentales robustes, traduisibles et reproductibles est nécessaire.

À l’heure actuelle, il existe des variations substantielles dans les protocoles signalés pour la conception de systèmes et la réalisation d’études pour soutenir le développement de thérapies assistées par cavitation. En ce qui concerne l’appareil, une gamme d’approches de conception a été entreprise. Plusieurs groupes ont utilisé des chambres à plaques parallèles56,61,62,63,construites sur mesure ou disponibles dans le commerce (par exemple, OptiCell, ThermoFisher Scientific). Hu et coll. (2013) ont développé une chambre cellulaire couplée à un module de sonication américain et à une imagerie confocale en temps réel64,Carugo et coll. (2015) ont utilisé un système comprenant une boîte de culture cellulaire disponible dans le commerce avec un couvercle PDMS sur mesure pour permettre la submersion dans un bain-marie pendant l’exposition américaine65, et Pereno et coll. (2018) ont utilisé un dispositif composé de résonateurs acoustofluidiques en couches qui permettent une caractérisation optique et acoustique simultanée de la dynamique des bulles et des interactions bulle-cellule66. L’utilisation de conceptions fabriquées sur mesure et spécifiques à l’application complique la caractérisation du champ américain et d’autres conditions d’exposition environnementale, ce qui rend les comparaisons d’études croisées difficiles. Par exemple, il existe une variation considérable dans les paramètres américains identifiés pour obtenir une sonoporation réussie, qui comprennent des fréquences centrales allant de 0,02 à 15 MHz, des cycles de service variant de 1% à une onde continue et des pressions de fabrication rares allant de 0,1 à 20 MPa23,64,67,68,69,70 (tableau 1). Il existe également une variation considérable dans les composantes spectrales (harmoniques, sous-harmoniques, etc.) qui ont été identifiées comme étant associées à des bioeffets particuliers.

L’objectif de ce travail est donc de fournir un cadre de conception et de mise en œuvre de systèmes facilement reproductibles pour l’étude in vitro des bioeffets cellulaires induits par la cavitation avec l’inclusion spécifique d’une capacité de surveillance de la cavitation.

Protocol

1. Principes de conception du système NOTA : Cette section présente les principes de conception utilisés pour créer des systèmes de surveillance de l’exposition et de la cavitation aux États-Unis. Ces principes sont illustrés par deux systèmes existants de transfection acoustique (SAT) (illustrés à la figure 1). Chaque système se compose d’un compartiment d’exposition cellulaire, d’une source américaine et d’un transducteur à un seul élément fonctionnant comme un détecteur de cavitation passive (PCD), qui sont tous intégrés dans une chambre d’essai de paillasse. Ces conceptions s’appuient sur le développement antérieur du système décrit dans Carugo et coll. (2015)65. Maximiser la facilité d’utilisation. Rendre le compartiment d’exposition cellulaire compatible avec les techniques de culture et les systèmes d’imagerie existants en utilisant les dispositifs de culture cellulaire commerciaux existants comme substrats d’ensemencement et de croissance. Pour SAT2, utilisez une capsule de culture (35 mm de diamètre, dont une zone de 21 mm de diamètre est observable, voir table des matériaux). Pour SAT3, utilisez un insert Transwell (6,5 mm de diamètre, voir table des matériaux). Les transwells ont une membrane perméable et doivent donc être placés dans un support cellulaire plutôt que dans de l’eau. Permettre le chargement et l’étanchéité rapides du compartiment d’exposition cellulaire. Formez le compartiment d’exposition de la cellule SAT2 en installant un couvercle en polymère flexible sur la parabole de culture (Carugo et al. 201565). Comme on le voit sur la figure 1C,le couvercle comporte une paire de trous de 1,2 mm de diamètre qui permettent de remplir le compartiment avec une seringue à aiguille émoussée de 18 G. Après le remplissage, scellez ces orifices de remplissage avec de courtes tiges en plastique(Table des matériaux). Remplissez le compartiment SAT3 avec une seringue ou une pipette et scellez en appuyant sur un bouchon / bonde en caoutchouc. Permettre le chargement rapide du compartiment d’exposition de la cellule scellée dans la chambre d’essai. Les supports des compartiments d’exposition des cellules ont été intégrés dans les couvercles de la chambre, où un léger ajustement de la presse est suffisant pour assurer un bon alignement. Avec les systèmes illustrés à la figure 1,le temps nécessaire aux changements d’échantillon peut être aussi court que 20 secondes lorsque plusieurs compartiments d’exposition cellulaire ont été préparés à l’avance. Réduisez le volume interne de la chambre afin que le système soit portable et que la quantité d’eau ou de milieux requis puisse être réduite au minimum. Cela accélère également la récupération des déversements accidentels ou des fuites d’agents de cavitation hors du compartiment d’exposition cellulaire.Remarque : le volume interne SAT2 est d’environ 0,8 L. Le volume interne SAT3 est d’environ 7,6 L – agrandi pour permettre un chargement et un changement faciles du transducteur source ou de sa configuration. Une chambre interne de 0,3 L a été ajoutée afin de réduire au minimum le volume jetable et de permettre l’utilisation de liquides biologiquement pertinents autres que l’eau de remplissage du réservoir (p. ex. milieu de culture cellulaire). Le fond de la chambre interne est fabriqué à partir d’une feuille de mylar de 30 μm d’épaisseur pour permettre une transmission acoustique maximale. Faites en sorte que la chambre et les composants internes soient à partir de matériaux optiquement clairs lorsque cela est possible, de sorte que tout problème (p. ex. fuites, macrobulles piégées) puisse être rapidement observé et corrigé. Maximiser la transmissibilité acoustique du compartiment d’exposition. Maximisez la transmissibilité grâce au choix de matériaux et d’épaisseurs de paroi de compartiment. En supposant que les liquides de chaque côté d’une paroi sont essentiellement les mêmes (p. ex. de l’eau), l’ampleur du coefficient normal de transmission de la pression d’incidence71 est la suivante :, où λ est la longueur d’onde dans la paroi de l’épaisseur L , , et z L et zo sont les impédances caractéristiques (produits de la densité et de la vitesse du son) pour le matériau de paroi et le liquide, respectivement. T = 1 indique une transmission parfaite. Pour la surveillance à large spectre de la cavitation (p. ex. 1-8 MHz), la plupart des polymères de laboratoire (p. ex. PDMS, PTFE, polystyrène) ne modifieront pas la pression transmise de plus de 10 % si l’épaisseur du matériau est inférieure à 1/10e d’une longueur d’onde dans le matériau. Cette condition peut être difficile à respecter avec des alimentations standard à des fréquences élevées (p. ex., #1,5 lamelle de couverture à 8 MHz), il est donc recommandé de prédire ou d’étalonner directement la réponse en fréquence de transmission. Pour la transmission en bande étroite du signal source américain dans le compartiment d’exposition de la cellule, autorisez une couche plus épaisse s’il s’agit approximativement d’un multiple entier d’une demi-longueur d’onde dans le matériau de la couche. Par exemple, le couvercle PDMS en SAT2 est utilisé à une épaisseur de 2,0 mm (~ 2 longueurs d’onde à 1 MHz, cPDMS ~ 1000 m/s). Maximisez la région d’exposition en sélection de l’environnement source et cellulaire. Pour maximiser le nombre de cellules exposées, rendez la zone de fixation des cellules aussi large que possible tout en maintenant la compatibilité avec l’équipement de culture et d’imagerie disponible. Utilisez une source américaine avec un champ qui s’étend sur la zone de fixation de la cellule avec une variabilité spatiale minimale en utilisant la région pré-focale d’une grande source focalisée (SAT2) ou une source focalisée ou à lentilles avec une largeur de lobe principal qui correspond au diamètre de la zone de fixation de la cellule (SAT3). Voir la table des matériaux pour des sources spécifiques. Minimiser la complexité du champ introduite par le support du compartiment de la cellule en soutenant mécaniquement le compartiment de la cellule bien loin de la partie la plus forte du champ incident, en minimisant la section transversale de diffusion du support ou en plaçant un matériau absorbant sur le support. Des exemples sont présentés à la figure 1A et 1D. Assurer des conditions d’exposition reproductibles. Terminer le champ acoustique dans une limite fixe pour éliminer la variabilité qui peut résulter des interfaces air-eau dans des chambres partiellement remplies. Dans SAT2 et 3, ceci est accompli en installant un absorbeur acoustique (voir la table des matériaux) sur le couvercle de la chambre avec un avantage supplémentaire de réduire la complexité du champ qui peut résulter des réflexions de limite. Surveillez et enregistrez la tension d’entraînement source à la sortie/entrée source de l’amplificateur afin que la variabilité mineure ou le dysfonctionnement majeur puisse être détecté rapidement. Utilisez une sonde de tension ou un autre dispositif sûr à utiliser sur la plage de tension d’entraînement d’intérêt. Vérifiez périodiquement l’étalonnage de la sonde de tension à l’aide d’une source bien connue telle qu’un générateur de forme d’onde. Contrôler, surveiller et enregistrer la température de la chambre et de son contenu. Les réponses des cellules, des transducteurs et du milieu de propagation peuvent toutes être sensibles à la température. Dans SAT2, la surveillance et le contrôle sont réalisés avec une paire de ports de circulation connectés à un système de conditionnement d’eau, tandis que SAT3 utilise un radiateur d’aquarium (non représenté). Réglez la température de l’eau au besoin pour imiter les conditions physiologiques pertinentes pour l’application thérapeutique.NOTA: les températures internes peuvent changer à la fois en raison de facteurs externes et du chauffage du transducteur et du milieu générés par les États-Unis. Dégaz soigneusement le ou les liquides de la chambre afin de réduire au minimum la probabilité d’une cavitation et/ou d’une diffusion involontaires à partir de bulles préexistantes dans le chemin de propagation.REMARQUE: si le dégazage n’est pas effectué, par exemple en raison de l’impact négatif sur les cellules, il y aura un niveau de fond amélioré de l’activité des bulles, pour lequel convient. Calibrez le système entièrement assemblé. Inclure un moyen de mesurer le champ de pression incident sur les cellules exposées lorsque tous les composants du système sont en place, y compris le compartiment d’exposition des cellules. En SAT2 et 3, ceci est accompli avec une ouverture dans le couvercle de la chambre à travers laquelle une aiguille ou un hydrophone à fibre optique pourrait être inséré sans perturber le champ à mesurer. Effectuez les mesures aussi près que possible de l’emplacement des cellules. Choisissez un hydrophone avec un rayon sensible (unrcv)est suffisamment petit pour ne pas fausser le champ de pression mesuré. La taille acceptable est fonction de la fréquence source(f)et du rayon(asrc)ainsi que de la distance entre la source et le balayage sur le terrain(zrcv). Un critère général pour le choix de la taille de l’hydrophone est: , conduisant à: , où c est la vitesse du son72. S’assurer que l’hydrophone est étalonné dans les conditions utilisées pour la caractérisation du système, y compris la température spécifiée à la section 1.6. Plus précisément, si l’hydrophone est maintenu à un angle par rapport au plan de balayage, l’hydrophone doit être étalonné à cet angle, car les effets de directivité peuvent différer considérablement de ceux attendus uniquement en fonction de la géométrie. Le changement de sensibilité de l’hydrophone par rapport à la température devrait être disponible auprès du fabricant. Analysez toute la région dans laquelle les cellules peuvent être exposées. Pour capturer un niveau approprié de détail de champ, utilisez un espacement de balayage non plus grossier que 1/5ème d’une longueur d’onde à la fréquence d’intérêt la plus élevée. Si une complexité inattendue du champ est observée, envisagez d’utiliser des signaux de rafale courts (p. ex. 1 à 3 cycles) pour permettre l’identification et la quantification des contributions directes et dispersées sur le terrain. Intégrer une capacité de surveillance de la cavitation. Déterminer le type et l’emplacement du transducteur de surveillance dans le cadre de la conception du système global, plutôt que comme une mise à niveau. En pratique, cela conduit à un système qui est le plus compact sans sacrifier la capacité d’aligner de manière fiable les composants critiques du système. Placez un dispositif de surveillance de la cavitation dans le système de manière à ce qu’il puisse être positionné de manière répétée avec un minimum de temps de configuration supplémentaire ou de perturbation du flux de travail. Dans SAT2, cela est accompli avec un transducteur piézoélectrique à un seul élément agissant comme un PCD monté dans le couvercle de la chambre, tandis que SAT3 intègre le PCD dans la base source à l’aide d’un réflecteur à 90 °. Sélectionnez la forme pcd en fonction des objectifs des expériences. Dans la figure 2,les calculs des contours de demi-amplitude des dispositifs flous (gauche) et focalisés (à droite) montrent les profondes différences de sensibilité spatiale par rapport à la fréquence. Le dispositif non focalisé est mieux adapté à la surveillance de grand volume avec une variation spatiale modeste par rapport à la fréquence, tandis que le dispositif focalisé est mieux adapté aux mesures plus radialement compactes aux fréquences d’intérêt. Sélectionnez la fréquence centrale et la bande passante pcd pour répondre aux besoins de l’expérience. La fréquence centrale est généralement choisie pour être au moins cinq fois supérieure à celle de la source américaine afin de minimiser la sensibilité aux émissions directes de la source. La bande passante est généralement maximisée afin d’observer un large éventail de comportements de bulles (bruit harmonique et à large bande). Sélectionnez des méthodes de conditionnement, d’enregistrement et de traitement pour permettre l’analyse des données de cavitation, comme décrit dans la section suivante. 2. Instrumentation et traitement pour la surveillance de la cavitation NOTA : Cette section présente les composantes et les fonctions de flux de signaux recommandées pour la collecte de données de surveillance de la cavitation, ainsi que le traitement des données qui mène à des évaluations qualitatives et quantitatives de l’activité de cavitation. Instrumentation (voir aussi figure 3). À moins que l’application ne nécessite un dispositif personnalisé, sélectionnez un PCD parmi la large gamme de transducteurs à élément unique disponibles dans le commerce, généralement commercialisés pour les essais non destructifs de cibles submergées. Ces fournisseurs ont également un câblage et des accessoires (p. ex., le réflecteur miroir dans SAT3). Réduire au minimum la réponse PCD à la source américaine. Cela peut être fait à la fois par la sélection du PCD (fréquence centrale et bande passante) et en utilisant un filtre cran ou passe-haut. Ce dernier est réalisable soit en tant que module autonome, soit dans le cadre d’un dispositif de conditionnement du signal. Utilisez un numériseur avec une grande plage dynamique (au moins 12 bits) pour capturer autant de données que possible avec une probabilité minimale d’écrêtage élevé du signal et un rapport signal sur bruit (SNR) maximal des signaux les plus petits. Lors de la comparaison des dispositifs, passez en revue les spécifications pour le signal au bruit et à la distorsion et/ou le nombre effectif de bits, car il s’agit de descriptions plus complètes de la plage dynamique atteignable. Déterminez également si la taille de la mémoire tampon est suffisante pour la longueur et le taux de capture de données souhaités. Optimisez l’utilisation de la plage dynamique du numériseur. Les signaux PCD peuvent couvrir plusieurs ordres de grandeur, à la fois en raison d’une longue exposition (lorsque les bulles sont éliminées) et en raison de l’exécution d’expériences à différents niveaux d’entraînement américains. Il est donc nécessaire de vérifier que la chaîne de conditionnement des signaux met à l’échelle tous les signaux afin qu’ils puissent être correctement enregistrés. Inclure un préamplificateur dans la chaîne de signaux, afin que les plus petits signaux attendus puissent être capturés de manière adéquate. D’après notre expérience, l’auto-bruit PCD est bien inférieur à celui de la plupart des numériseurs, de sorte qu’un degré modeste de préamplification (par exemple, <100x) peut toujours améliorer le SNR du résultat final. Filtrez la fréquence source us avant la préamplification pour éviter de saturer l’amplificateur. Si un pulseur/récepteur américain est utilisé pour fournir des capacités de gain et/ou de filtrage, utilisez-le en mode pulseur pour confirmer la longueur/l’alignement du trajet ou vérifier la recherche de diffuseurs inattendus dans le chemin de propagation entre le PCD et le compartiment d’exposition cellulaire. Activez la diffusion en continu en temps réel des données vers le stockage. Les systèmes SAT2 et SAT3 utilisent tous deux des oscilloscopes USB en streaming 12 bits (voir la table des matériaux), qui ont les commodités de la portabilité et des interfaces utilisateur bien construites. Confirmez l’adaptation d’impédance appropriée dans la chaîne de signaux pour éviter les erreurs de gain ou de bande passante. Les dispositifs PCD ont généralement des impédances de sortie proches de 50 ohms, donc un processus approprié consiste à remplacer le PCD par un signal connu d’un générateur de forme d’onde (avec une impédance de sortie de 50 ohms) et à confirmer que la taille du signal apparaissant sur le numériseur correspond aux attentes, s’adapte linéairement lorsque le signal injecté est modifié et qu’aucun écrêtage n’est observé pour le plus grand signal d’intérêt. Prétraitement Corrigez les signaux de tension brute pour tous les gains et sensibilités connus dans le chemin du signal qui se rapportent au traitement des données dans la gamme de fréquences d’intérêt. Si les données ont été enregistrées avec un couplage d’entrée CC ou affichent un décalage CC, supprimez ce décalage par soustraction directe ou avec un filtre passe-haut. Calculer le spectre de puissance P de chaque signal enregistré. Définissez la longueur de la transformée de Fourier Nft de sorte que la fréquence fondamentale de la source us f0 soit un grand multiple entier de la largeur du groupe de transformation: Nft =   nfs/f0, où n est un entier et fs est la fréquence d’échantillonnage des données numérisées. Définissez n ≥ 50 pour une capture claire des caractéristiques spectrales. Pour l’exemple d’un échantillon fondamental de 1 MHz à 50 MHz, Nft est de 2500 et la largeur du bac est de 0,02 MHz. Comme la longueur de transformation Nft est généralement inférieure à la durée du signal enregistré, utilisez un estimateur de densité spectrale de puissance(PSD)tel que la méthode de Welch73. La puissance dans une bande de fréquences s’étendant sur f1-f2 est , où dF est la largeur du bac de transformation. Pour caractériser l’activité des bulles lors de chaque exposition, estimez les contributions au spectre de puissance à partir de multiples entiers de f0 (harmoniques), de multiples entiers impairs de f0/2(ultraharmoniques) et de bruits à large bande (cavitation inertielle). Le contenu harmonique et ultraharmonique est le plus simplement estimé en sélectionnant les valeurs du spectre de puissance à des fréquences spécifiques. Cependant, les réponses tonales de grande amplitude peuvent se propager dans un petit nombre de groupes de fréquences adjacents (par exemple f0 ± 2-3), de sorte que ceux-ci devraient être inclus dans les calculs de puissance à bande étroite et exclus des calculs à large bande. Estimer la puissance de cavitation de bande large bande en soustrayant les contributions harmoniques et ultraharmoniques du spectre de puissance total. Alternativement, ces contributions peuvent être estimées à l’aide d’un prétraitement plus sophistiqué74. Estimer l’énergie cumulée du signal de cavitation sur la durée de l’exposition, de préférence en fonction du type d’activité spectrale/bulle. En supposant que tous les enregistrements de données avaient une durée égale Tr, l’énergie cumulée dans les données enregistrées est , où M indique le nombre d’enregistrements. S’il y a des écarts entre les enregistrements, comme cela peut se produire lorsque l’exposition est continue, et que les fichiers sauvegardés capturent une fraction de la durée totale d’exposition Te, l’énergie cumulée peut être estimée comme suit : Estimer la mesure SNR en comparant les niveaux de spectre avec ceux du bruit de fond enregistré en l’absence de US. 3. Protocole expérimental Préparation SAT Minimiser la probabilité de cavitation dans le chemin de propagation en dégazant le liquide de remplissage (généralement de l’eau filtrée) sous une pression de -105 Pa pendant au moins deux heures. Il est recommandé de confirmer avec une sonde à oxygène dissous que la pression partielle de l’oxygène est inférieure à 10 kPa. Remplissez la chambre d’essai lentement pour minimiser la réintroduction d’air dans le liquide dégazé. Continuer à dégazer la chambre remplie si nécessaire. Nettoyez toutes les bulles résiduelles des surfaces du transducteur et du récipient du support immédiatement après le remplissage et de nouveau juste avant de lancer des expériences d’exposition. Assurez-vous que la température de la chambre et son contenu se sont stabilisés avant de commencer les expériences d’exposition. Permettre à l’amplificateur de puissance source américain de se réchauffer (selon la recommandation du fabricant) afin que le gain et la sortie soient stables par rapport au temps. Préparation du compartiment d’exposition Suspension d’agent de cavitation Lors de la dilution de l’agent de cavitation, remuer doucement et continuellement pour faire une suspension uniforme sans piétiner les macrobulles ou détruire l’agent (surtout s’il s’agit de bulles décortiquées). Lorsque vous travaillez avec des BM, retirer et distribuer lentement à l’aide de la plus grande aiguille de jauge disponible pour minimiser la destruction pendant le processus de chargement75. Une aiguille de remplissage émoussé de 18 G a été utilisée régulièrement avec les systèmes SAT. Préparation SAT2 Stérilisez le couvercle PDMS avant utilisation dans des expériences avec des cellules vivantes. Formez le compartiment d’exposition de la cellule en appuyant sur le raccord du couvercle PDMS à la parabole de culture. Préparez une seringue avec une aiguille émoussée de 18 G et remplissez-la d’environ 10 mL de liquide (p. ex. suspension de MB ou contrôle de l’eau). Insérez l’aiguille à travers l’un des trous de remplissage PDMS et remplissez lentement la chambre, en inclinant de sorte que les macrobulles puissent s’échapper à travers le trou de remplissage ouvert. Pour de meilleurs résultats, inclinez la chambre de sorte que le trou ouvert soit au-dessus du trou de remplissage. Une fois rempli, fermez le trou ouvert en insérant une courte tige de polymère (4-5 mm). Définissez l’assemblage de manière à ce que les deux trous soient horizontaux. Retirez l’aiguille de remplissage émoussé tout en injectant du liquide supplémentaire afin que l’air ne soit pas aspiré. Fermez le trou avec une autre tige en polymère. Ce processus complète l’étanchéité du compartiment d’exposition cellulaire. Vérifier visuellement le compartiment pour déceler tout signe de macrobulles piégées et, s’il en trouve, répéter 3.3.3.-3.3.6. Appuyez sur ajuster le compartiment d’exposition de la cellule dans le support du compartiment. Installez le couvercle de la chambre en place au-dessus de la chambre. Abaisser le couvercle avec un angle horizontal décourage les macrobulles de se reposer sur les pièces immergées (absorbeur, support). Tenez compte de la flottabilité des particules en suspension au moment de décider de l’orientation du compartiment d’exposition des cellules (p. ex. bulles flottantes ou nanoparticules enfonnantes) et de la façon dont cela affectera leur contact avec les cellules. Dans toutes les opérations, utilisez le moins de force possible pour minimiser la flexion de la surface de croissance cellulaire et le détachement des cellules. Préparation SAT3 Remplissez le puits trans avec environ 150 μL de liquide (p. ex. suspension de BROMURE de méthyle ou contrôle de l’eau). Formez le compartiment d’exposition des cellules en scellant soigneusement le puits de transbordement avec un bouchon en caoutchouc, en enlevant tout liquide de débordement avec une serviette en papier propre ou une lingette. Avant utilisation dans des expériences avec des cellules vivantes, stérilisez le bouchon en caoutchouc. Vérifiez visuellement le compartiment pour déceler des signes de macrobulles piégées et, le cas échéant, retirez le bouchon, retirez les macrobulles et répétez 4.4.2. Appuyez sur ajuster le compartiment d’exposition de la cellule dans le support du compartiment. Installez le couvercle de la chambre en place au-dessus de la chambre. Abaisser le couvercle avec un angle horizontal décourage les macrobulles de se reposer sur les pièces immergées (absorbeur, support).NOTA : Comme il est indiqué ci-dessus, les macrobulles peuvent causer divers effets non reproductibles et potentiellement préjudiciables sur les expériences d’exposition aux États-Unis. Plus critique encore, les macrobulles piégées dans le compartiment d’exposition cellulaire peuvent provoquer des réponses à la PCD et des bioeffets cellulaires locaux qui ne sont pas représentatifs du traitement prévu. Inspectez toujours visuellement tous les composants du système pour trouver et supprimer les macrobubbles avant de lancer des expériences américaines. 4. Collecte de données Établir les niveaux de réponse de fond à la PCD en menant des expériences initiales avec un compartiment d’exposition cellulaire rempli de liquide témoin (p. ex. eau dégazée ou milieu cellulaire). Enregistrez les données PCD sans conduire la source américaine pour établir les niveaux de bruit électronique de fond. Enregistrez les données PCD tout en conduisant la source américaine à la gamme complète des niveaux de lecteur prévus. Ces données indiqueront quelles parties de la réponse acoustique ne sont pas liées aux agents de cavitation qui seront testés par la suite.NOTA : Les liquides de laboratoire courants (p. ex. PBS ou milieux cellulaires) présenteront une cavitation à des pressions modérées (p. ex. 0,5 MPa à 0,5 MHz) s’ils ne sont pas dégazés. Avant de commencer les mesures, donnez le temps à la suspension de s’équilibrer thermiquement avec la température de la chambre. Un thermocouple à aiguille fine peut être utile à cette fin. Surveillez les expériences en temps réel dans les domaines temporel et fréquent. La surveillance du domaine temporel du PCD révèle si les signaux sont dimensionnés de manière appropriée pour les paramètres d’instrumentation actuels. Plus précisément, l’écrêtage du signal est à éviter, car il apparaîtra dans le domaine fréquentiel comme une réponse harmonique multicolore. La surveillance du domaine temporel de la PCD montre également si les signaux de cavitation sont vus plus tôt que prévu en fonction du temps de propagation de la source américaine au compartiment d’exposition à la PCD. Si de tels signaux sont observés, cela peut indiquer une fuite de l’agent de cavitation dans la chambre d’essai. La surveillance du domaine fréquentiel du PCD indique le type de comportement de la bulle et peut être utilisée pour ajuster les niveaux d’entraînement au besoin pour obtenir le stimulus cellulaire souhaité (par exemple, des niveaux d’entraînement inférieurs pour l’excitation harmonique). Pour vous assurer que les premières expositions ne sont pas manquées, démarrez le processus de collecte de données avant d’activer le signal du lecteur source américain. Surveillez le signal de sortie de l’amplificateur qui entraîne la source américaine (par opposition à la sortie du générateur de forme d’onde) tout au long de l’expérience pour vous assurer que l’exposition se déroule comme prévu. Utilisez une sonde haute tension pour cette mesure et assurez-vous que l’oscilloscope est réglé pour compenser l’atténuation de la sonde. Après avoir exposé un échantillon, retirez-le soigneusement de la chambre d’essai. Retirez et nettoyez le couvercle PDMS (SAT2)/le bouchon en caoutchouc (SAT3) en vue de toute utilisation ultérieure. Transférer la parabole de culture (SAT2)/Transwell (SAT3) au besoin pour une analyse ultérieure (p. ex. microscopie, imagerie par fluorescence). Après un petit nombre d’expositions (p. ex. 3-5), il est de bonne pratique de réappréger les signaux de cavitation de base (en l’absence d’agent de cavitation) et de les comparer à l’ensemble de données d’origine pour s’assurer que les milieux de chambre n’ont pas été contaminés.

Representative Results

La figure 4 montre des exemples de réponses PCD dans le domaine temporel et fréquentiel, illustrant trois comportements de cavitation distincts. Toutes les données ont été recueillies sur SAT3 à l’aide de SonoVue MBs dilués 5x dans du PBS, avec une concentration finale d’environ 2*107 MBs/ml. La température pour tous les exemples de cette section était de 19 ± 1 °C. La source américaine a été entraînée avec une impulsion de 2,0 ms à 0,5 MHz pour atteindre des pressions négatives de pointe incidentes de 0,20(figures 4A et 4B),0,30(figure 4C et 4D)et 0,70 MPa(figures 4E et 4F). Les enregistrements de signaux ont commencé 1,4 ms avant le début t = 0 de l’impulsion américaine. Les traces en médaillon montrent le signal tel qu’enregistré (rouge) et avec un filtre passe-haut de 2 MHz (bleu) pour une fenêtre de temps centrée au moment du vol de la source au compartiment d’exposition de la cellule à PCD. La réponse de bas niveau avant cette heure est due au rayonnement directement reçu de la source, ce qui est courant dans les configurations où le PCD est derrière la source américaine. À la pression incidente la plus basse, la réponse PCD se compose entièrement d’harmoniques entières de la fréquence fondamentale américaine de 0,5 MHz. L’augmentation de 0,20 à 0,30 MPa entraîne des ultraharmonies prononcées dans le spectre en plus d’harmoniques entières encore plus élevées. Les formes d’onde du domaine temporel à ces deux pressions semblent similaires, bien que les résultats de 0,30 MPa montrent une plus grande variabilité sur la durée de l’impulsion. À la pression la plus élevée, l’amplitude de la forme d’onde du domaine temporel a augmenté de manière non linéaire par rapport aux pressions plus faibles en raison du bruit à large bande clairement élevé visible dans le spectre. Ce bruit est communément considéré comme le résultat d’une cavitation inertielle et dans cet exemple, correspond à la destruction des MBs. Pour y voir plus clair, les réponses PCD en fonction du temps sont illustrées à la figure 5. Dans le panneau de gauche(Figure 5A),des spectres complets sont affichés sur un temps d’exposition de 50 secondes, au cours duquel la source émet 2,0 ms d’impulsions toutes les 0,20 secondes. Les puissances totales, harmoniques et large bande correspondantes sont indiquées dans le panneau de droite(Figure 5B). Les États-Unis ont été activés à t = 3 ,0 s, moment auquel des réponses à large bande de grande amplitude ont été observées. On pense que le pic initial correspond à la destruction des plus grandes bulles de la suspension (SonoVue est polydisperse) et est une observation courante dans les expériences de cavitation avec des bulles décortiquées et même avec des milieux non dégazés (par exemple, PBS). Après quelques secondes, la réponse à large bande a rapidement diminué, apparemment en raison de la destruction des bulles, et le signal est principalement composé d’harmoniques. Cela suggère que le gaz libéré et les MBs restants vibrent de manière stable et non inertielle. À t ~ 50s, la composante large bande est tombée au niveau du bruit de fond d’origine. Des tests d’exposition comme celui-ci sont donc importants pour essayer de comprendre les échelles de temps pendant lesquelles différents effets de bulle peuvent agir sur les cellules de la chambre. Les bulles sont susceptibles de se traduire en réponse aux forces de rayonnement générées pendant l’exposition aux États-Unis et le mouvement des BM à l’extérieur et à l’extérieur du champ de vision pcd peut conduire à une variabilité accrue du signal de cavitation surveillé, en particulier lorsqu’il s’agit de suspensions diluées. La région sensible de la PCD devrait donc couvrir autant que possible la surface d’exposition cellulaire. Une comparaison des réponses focalisés et non focalisés PCD avec des fréquences centrales identiques (voir figure 2)est illustrée à la figure 6,en utilisant une dilution 20:1 des MBs dans le PBS normal est SAT2. Les spectres moyennés par le temps et l’échantillon dans le panneau Figure 6A montrent que le PCD non focalisé contient une réponse large bande plus forte, accompagnée d’une variabilité réduite d’échantillon à échantillon dans les puissances harmoniques(Figure 6B)et ultraharmoniques(Figure 6C). Il est important de reconnaître que les milieux utilisés pour le travail cellulaire in vitro ne sont pas dégazés et peuvent présenter un niveau de fond accru d’activité des bulles. La figure 7 montre la réponse en SAT2 du PBS utilisé sous sa forme fournie par le fournisseur et après deux heures de dégazage sous vide, après quoi la saturation en air a été réduite de 92% à 46% comme déterminé avec un capteur optique (PreSens, Allemagne). Les spectres de la figure 7A ont fait l’état d’une moyenne sur le temps d’exposition et les répétitions avec cinq échantillons indépendants, et montrent clairement des ultraharmoniques clairement élevées dans le PBS normal. Les puissances additionnées sur trois harmoniques(Figure 7B)sont bien dans l’écart type de chaque sortie expérimentale. En revanche, les sommes ultraharmoniques de la figure 7C montrent que le PBS normal a un niveau presque d’un ordre de grandeur plus élevé et une variabilité sensiblement plus élevée entre les échantillons. Ces exemples indiquent qu’un milieu commun compatible avec les cellules peut présenter des comportements qui pourraient être (incorrectement) attribués à la présence de MBs. Puisqu’il est habituellement peu pratique de dégazer le milieu de culture en raison de l’impact négatif sur les cellules et/ou la stabilité d’agent de cavitation, il est essentiel d’exécuter des contrôles appropriés dans n’importe quelle étude cavitation-connexe. Figure 1 : Illustrations de deux conceptions de systèmes d’exposition américains intégrant la surveillance de la cavitation : SAT3 (D-F). (A) Ensemble annoté SAT2 avec paroi latérale enlevée pour plus de clarté. (B) SAT2 avec paroi latérale intacte. (C) Compartiment d’exposition des cellules SAT2, démonté. (D) Assemblage annoté SAT3. (E) SAT3 dans des configurations normales (gauche) et à lentilles (droite) pour l’appariement de largeur de faisceau à différentes fréquences. (F) Compartiment d’exposition de cellules SAT3, démonté. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. Figure 2 : Calculs des contours de champ de pression de demi-amplitude pour les transducteurs flous (gauche) et focalisés sphériquement (à droite) de diamètre. Les fréquences de 2, 4 et 8 MHz sont représentées par des contours rouge, bleu et vert, respectivement, pour un élément PCD à l’origine de la coordonnée (0,0). Les contours les plus à l’extérieur du dispositif flou sont relativement insensibles à la fréquence, mais la structure intérieure dépend de la fréquence. Le champ focalisé sphériquement se contracte à mesure que la fréquence augmente, mais à l’intérieur des contours, les champs varient en douceur. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. Figure 3 : Instrumentation pour le conditionnement et l’enregistrement du signal de cavitation (flèches bleues), l’excitation de la source américaine (lignes rouges) et le déclenchement de l’acquisition de données. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. Figure 4 : Réponses PCD temporelles (à gauche) et fréquentiels (à droite) enregistrées avec des BM diluées 5x dans du PBS. Les pressions négatives maximales de l’incident étaient (A, B) 0,2 MPa, (C, D) 0,4 MPa, (E, F) 0,7 MPa, le tout à 0,5 MHz. Les enregistrements de signaux commencent 1,4 ms avant le début t = 0 de l’impulsion ultrasonore de durée de 2,0 ms. (A, C, E) Les signaux du domaine temporel (rouge) sont affichés sur une échelle verticale fixe, indiquant comment le niveau de réponse change avec la pression incidente. Les traces en médaillon montrent le signal tel qu’enregistré (rouge) et avec un filtre passe-haut de 2 MHz (bleu) pour une fenêtre de temps centrée au moment du vol de la source au compartiment d’exposition de la cellule à PCD. (B, D, F) Les densités spectrales de bruit et de puissance du signal sont calculées pour t0, respectivement. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. Figure 5 : Historique du spectre sur une exposition de 50 secondes d’une suspension de MBs diluée 5x dans du PBS. (A) Spectres complets et (B) puissances totales, harmoniques et de signaux à large bande, le tout en fonction du temps. Les conditions d’entraînement étaient de 0,5 MHz, de pression négative maximale de 0,7 MPa, de durée d’impulsion de 2,0 ms, de période de répétition d’impulsion de 200 ms. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. Figure 6: Effet de la géométrie de mise au point de la PCD enregistré avec une dilution 20:1 des microbulles dans le PBS normal. Les conditions d’entraînement étaient les suivantes : 1,0 MHz, 0,50 MPa de pression négative maximale, durée d’impulsion de 3,0 ms, période de répétition d’impulsion de 10 ms. (A) Spectres complets moyennés sur le temps d’exposition et trois répétitions indépendantes de l’échantillon. (B) Puissance en harmoniques de 3, 4 et 5 MHz, et puissance(C)en ultraharmoniques de 2,5, 3,5 et 4,5 MHz. Les lignes épaisses sont des moyennes d’échantillonnage, les zones ombragées indiquent +/- 1 écart type. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. Figure 7: Effet des milieux dégazés enregistrés avec du PBS. (A) La moyenne des spectres complets sur le temps d’exposition et cinq répétitions indépendantes de l’échantillon. (B) Puissance en harmoniques de 3, 4 et 5 MHz, et puissance(C)en ultraharmoniques de 2,5, 3,5 et 4,5 MHz. Les lignes épaisses sont des moyennes d’échantillonnage, les zones ombragées indiquent +/- 1 écart type. Les conditions d’entraînement étaient de 1,0 MHz, de pression négative maximale de 0,50 MPa, de durée d’impulsion de 1,0 ms, de période de répétition d’impulsion de 200 ms. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. paramètre unité minimum maximum fréquence Mhz 0.02 15 pression (pic négatif) Mpa 0.1 20 longueur de l’impulsion Cycles 1 Cw cycle d’affectation % 1 Cw temps d’exposition s 10 1000 Tableau 1 : Résumé de la gamme de paramètres rapportés facilitant la sonoporation in vitro.

Discussion

Les étapes critiques pour toute mesure acoustique ont été encapsulées par Apfel en 198176 comme « connais ton liquide, connais ton champ sonore, sache quand quelque chose se passe. » Dans le contexte de ce protocole, ceux-ci englobent l’étalonnage et l’alignement du transducteur ainsi que les étapes de préparation de l’eau et de manipulation des bulles. Tout d’abord, il est essentiel que l’hydrophone utilisé pour étalonner le transducteur d’entraînement et/ou le PCD soit lui-même étalonné avec précision grâce à un entretien externe régulier ou à une comparaison interne avec un étalon de référence. De même, la réponse du transducteur de conduite et du PCD doit être régulièrement caractérisée pour vérifier tout changement de sortie et/ou perte de sensibilité. Si les conditions de conduite et la sensibilité de réception du système sont inconnues, il sera alors impossible de déduire une relation significative entre les conditions d’exposition, les effets biologiques et les émissions acoustiques. Directement lié à cela, l’alignement des transducteurs les uns sur les autres et de la chambre d’échantillonnage doit être soigneusement vérifié pour s’assurer que les conditions d’exposition à l’intérieur de la chambre sont conformes aux attentes et que le volume d’échantillonnage pour le PCD correspond à la région d’intérêt. Comme indiqué, la température et la teneur en gaz du milieu de suspension peuvent affecter de manière significative les résultats finaux et la cohérence est extrêmement importante à cet égard77,78. De même, la préparation, la caractérisation et la manipulation de la suspension de l’agent de cavitation nécessitent une attention toute particulière pour s’assurer que la distribution granurique et la concentration attendues des particules sont présentes dans l’échantillon. Par exemple, si la concentration de bulles est trop élevée, il y aura un blindage efficace du volume d’échantillon du champ américain incident. Les agents mb sont particulièrement sensibles à la destruction et à la coalescence et d’autres conseils sur leur manipulation peuvent être trouvés dans Mulvana et. (2012)79.

Un problème très courant avec la détection des signaux de cavitation est d’obtenir un SNR adéquat. Cela est dû en partie à la nature du signal lui-même, tel que décrit, mais peut également être dû à des sources de bruit électrique au sein de l’installation expérimentale. La vérification des connexions entre les composants du système, en particulier ceux impliquant des câbles coaxiaux, peut aider à éliminer certains d’entre eux. Il peut être nécessaire de remplacer ou de réparer les câbles coaxiaux. Il peut également être utile d’identifier et de retirer ou de désactiver d’autres équipements en laboratoire, comme les pompes qui peuvent causer du bruit électrique. Une mauvaise adaptation de l’impédance électrique entre les composants du système peut être une autre cause de mauvais rapport signal/bruit et aussi potentiellement de dommages à l’équipement et doit être soigneusement vérifiée. Les paramètres de déclenchement sur le générateur de signaux et l’oscilloscope doivent également être vérifiés pour confirmer qu’ils sont configurés de manière appropriée pour l’expérience et qu’ils ne sont pas revenus aux paramètres par défaut du fabricant. S’il y a une destruction importante des bulles pendant la manipulation, dans le cas du SAT2, il peut être utile de fixer une deuxième seringue à l’orifice de sortie et de l’utiliser pour extraire doucement le fluide de la chambre, attirant ainsi la suspension. Cela peut également aider à éliminer les macrobulles ou à permettre le flux pendant l’exposition aux États-Unis, si vous le souhaitez.

Il n’est pas possible d’éliminer complètement les réflexions acoustiques à l’intérieur de la chambre d’échantillonnage et, par conséquent, le champ incident ne sera pas complètement uniforme sur l’ensemble du volume de l’échantillon. Comme indiqué aux étapes 1.3.2 et 1.3.3, la transmissibilité des fenêtres acoustiques dépendra de la fréquence et la largeur de bande souhaitée pour les mesures des émissions acoustiques devrait donc être soigneusement examinée. En particulier, il peut y avoir des réflexions multiples significatives de composants de fréquence plus élevée. C’est une autre raison pour laquelle l’étalonnage du champ dans le système entièrement assemblé est si important pour minimiser l’incertitude de la pression incidente. Un gating approprié des signaux enregistrés devrait également être envisagé pour minimiser les effets des réflexions multiples. L’utilisation de dispositifs commerciaux pour des raisons de commodité et le besoin de transparence acoustique signifient qu’une certaine transparence optique doit être sacrifiée. Cela peut avoir une incidence sur la qualité de l’imagerie subséquente, p. ex., pour évaluer la viabilité cellulaire ou l’absorption du médicament. Certaines des membranes utilisées dans les dispositifs commerciaux sont également poreuses et, par conséquent, une isolation imparfaite se produit entre la chambre d’échantillonnage et le bain-marie environnant. Comme ci-dessus, le risque de contamination correspondant peut être atténué en utilisant une sous-chambre plus petite, dont le contenu peut être régulièrement remplacé. Les dispositifs de culture cellulaire indiqués dans la table des matériaux conviennent principalement aux monocouches cellulaires qui peuvent ne pas être représentatives des tissus en termes de tous les effets biologiques médiés par les États-Unis et la cavitation. La proximité des cellules par rapport à une surface solide affectera également la dynamique du bromure de méthyle d’une manière qui peut ne pas refléter les conditions in vivo, p. ex., en favorisant le microstreaming et le microjetting comme décrit dans l’introduction. Ces limitations peuvent être abordées, cependant, par une simple substitution des modèles alternatifs de tissu.

L’objectif de la proposition des SAT est de fournir un moyen d’améliorer la reproductibilité des conditions d’exposition acoustique et des émissions acoustiques entre les études des bioeffets médiés par les États-Unis, facilitant ainsi, espérons-le, une meilleure compréhension des mécanismes sous-jacents et le développement de techniques de surveillance du traitement pour améliorer la sécurité et l’efficacité. Les systèmes sont conçus pour être compatibles avec les dispositifs de culture cellulaire disponibles dans le commerce, permettant d’effectuer un large éventail d’essais biologiques en fonction de l’application d’intérêt et permettant la réalisation d’expériences à haut débit, éliminant ainsi le besoin de procédures d’alignement fastidieuses entre les essais. En normalisant les protocoles de caractérisation des conditions d’exposition et de capture des émissions acoustiques, nous espérons que la variabilité dépendante du système pourra être réduite. La gamme de paramètres qui devraient être explorés pour une expérience particulière dépendra de l’application (bio-effet désiré, type de cellule, profondeur du tissu cible si in vivo, etc.) et de la nature de tout agent de cavitation utilisé. Étant donné le grand nombre de variables (fréquence us, amplitude de pression, longueur d’impulsion, fréquence de répétition d’impulsions, etc.), il est peu probable qu’il soit possible d’explorer pleinement l’ensemble de l’espace des paramètres. Un avantage du protocole proposé est qu’il permet d’établir rapidement certaines limites de cet espace de paramètres. Par exemple, il permet de déterminer la pression minimale à laquelle un signal de cavitation est généré, la pression maximale ou la longueur d’impulsion qui peut être utilisée avant le détachement / mort de la cellule, et la pression à laquelle les harmoniques fractionnaires ou le bruit à large bande sont produits. Il est recommandé qu’un tel ensemble de mesures de la portée soit effectué comme première étape de toute étude.

Comme nous l’avons présenté, les SAT sont conçus pour la surveillance en temps réel des émissions acoustiques, des essais biologiques étant effectués en dehors de l’expérience. Il serait cependant relativement simple de modifier le SAT pour permettre l’observation optique directe de la chambre d’échantillonnage via un objectif de microscope. Cela pourrait à son tour être couplé à un système de fluorescence et /ou de microscopie à grande vitesse pour permettre l’observation de l’absorption des médicaments et de la dynamique des bulles, par exemple. La sortie PCD telle qu’elle est actuellement présentée en termes de tension indique: i) les types de comportement de cavitation et leurs proportions relatives; ii) combien de temps ces comportements de cavitation persistent; iii) si les caractéristiques d’exposition cumulative dans le temps observées sont corrélées à un effet biologique particulier; et iv) si les niveaux relatifs et les comportements dépendant du temps sont compatibles avec les expériences précédentes dans le système d’exposition. Bien que la sensibilité à la réception de la PCD puisse être quantifiée, afin de caractériser de manière fiable les émissions acoustiques en termes d’énergie absolue, des informations spatiales supplémentaires sont nécessaires. Cela pourrait être réalisé en remplaçant le PCD par une sonde réseau pour mettre en œuvre la cartographie acoustique passive (PAM)80. Cela augmenterait toutefois la complexité du traitement du signal ainsi que le temps de calcul et la puissance nécessaires.

D’autres instruments de mesure de la résistance électrique de la membrane ou d’application de méthodes de ciblage physique, par exemple des champs magnétiques, pourraient également être incorporés. Il serait également possible d’utiliser des structures tissulaires tridimensionnelles telles que des sphéroïdes tumoraux, des organoïdes ou même des échantillons de tissus ex vivo sur des substrats de gel acoustiquement « mous » à la place des monocouches cellulaires pour étudier les effets américains et médiés par la cavitation dans des environnements tissulaires plus réalistes.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Les auteurs remercient le Conseil de recherches en génie et en sciences physiques d’avoir soutenu ces travaux par le biais de la subvention EP/L024012/1. VB est également soutenu par le Engineering and Physical Sciences Research Council (EPSRC) et le Medical Research Council (MRC) (subvention EP/L016052/1). VB et AV remercient la Fondation Clarendon pour les bourses d’études supérieures. AV remercie également Exeter College pour une bourse Santander. Les auteurs sont redevables à James Fisk et David Salisbury pour leur aide inestimable dans la fabrication de l’appareil. Ils remercient également les Drs Dario Carugo et Joshua Owen pour leur contribution à l’élaboration de prototypes antérieurs de SAT.

Materials

Absorber Precision Acoustics APTFlex F28 panel 1.0 cm standard thickness
Amplifier (power) E&I Ltd. 1040L 400W power amplifier to drive ultrasound source
Amplifier (pre) Stanford Research Systems SR445A Fixed gain multi-stage preamplifier for PCD signals
Aquarium heater Aquael Ultra 50W Different models for different tank sizes.
Digitizer TiePie Engineering HS5-110-XM Extended memory option: 32M points per channel
Hydrophone Precision Acoustics FOH 0.01 mm diameter sensitive area minimises directivity effects
Microbubbles Bracco SonoVue FDA approved microbubbles
PCD mirror (SAT3) Olympus NDT F-102 90 degree beam reflection
PCD transducer Olympus NDT V320-SU Immersion transducer, 7.5MHz
PCD waterproof cable Olympus NDT BCU-58-1 W
PDMS (SAT2 compartment lid) Corning Sylgard 184 See Carugo et al. (2015) for preparation guidelines
Polymer rod (SAT2 seal) Zeus PTFE monofilament
Rubber plug (SAT3 lid/seal) VWR 391-2101 6mm bottom dia., 8mm top dia., red
Signal generator Agilent 33250 Waveform generator for ultrasound source
Substrate for cell exposure compartment, SAT2 Ibidi µ-Dish 35mm
Substrate for cell exposure compartment, SAT3 Corning Transwell 6.5mm
Ultrasound source (SAT3) Sonic Concepts H107 with central hole Use of a HIFU-capable source allows pressures >1MPa to be generated both at the focus and pre-focally for expanded spatial coverage
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Gray, M., Vasilyeva, A. V., Brans, V., Stride, E. Studying Cavitation Enhanced Therapy. J. Vis. Exp. (170), e61989, doi:10.3791/61989 (2021).
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