JoVE Journal > Bioengineering
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Türkçe

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Bioengineering

Kavitasyon Gelişmiş Tedavi Çalışma

Published: April 09, 2021
doi:
10.3791/61989
, , ,
1Institute of Biomedical Engineering,University of Oxford

Summary

Sunulan deneysel protokol, başarılı ilaç dağıtımı ve/veya diğer biyoeffeksler için gerekli koşulların araştırılmasını sağlamak amacıyla bir hücre kültürü cihazında kavitasyon aktivitesinin gerçek zamanlı ölçümlerini yapmak için kullanılabilir.

Abstract

Ultrasonun terapötik uygulamalarına olan ilgi, kanserden Alzheimer hastalığına kadar potansiyel klinik hedeflerle önemli ve artmaktadır. Kavitasyon – bir ultrason alanında kabarcıkların oluşumu ve sonraki hareketi – bu tedavilerin çoğunu destekleyen önemli bir fenomeni temsil eder. Bununla birlikte, kavitasyonun terapötik etkileri teşvik ettiği ayrıntılı etki mekanizmaları konusunda önemli bir belirsizlik vardır ve klinik olarak uygulanabilecek güvenilir izleme teknikleri geliştirmeye ihtiyaç vardır. Özellikle, terapötik etkilerin başarıyla teslim ettiği bildirilen maruz kalma parametrelerindeki çalışmalar ile buna karşılık gelen akustik emisyonlar arasında önemli farklılıklar vardır. Bu makalenin amacı, kavitasyon aracılı biyoeffekslerin çalışmalarını gerçekleştirmek için yaygın olarak bulunan bileşenleri kullanarak tasarım kılavuzları ve deneysel bir protokol sağlamak ve gerçek zamanlı akustik izlemeyi dahil etmektir. Protokolün, akustik izlemenin terapötik ultrason deneylerine daha yaygın bir şekilde dahil edilmesini sağlayacağı ve maruz kalma koşulları ve ilgili biyo-efektlerle korelasyonu çalışmaları arasında daha kolay karşılaştırmayı kolaylaştıracağı umulmaktadır.

Introduction

Ultrason (ABD), güvenli ve invaziv olmayan doğası, hastanın başucunda uygulama kolaylığı ve maliyet etkinliği nedeniyle tanısal görüntüleme tekniği olarak yaygın olarak kullanılmaktadır1. Tanılama ve izleme yeteneklerinin yanına, ABD terapötik uygulamalar için önemli bir potansiyele sahiptir. İlkçalışmalar trombolizde kullanımını araştırdı, DNA transfeksiyonu ve ilaç dağıtımı 2,3,4 ve terapötik ABD artık tümör tedavisi 5 , 6 ,7, immünoterapi8,9,kan-beyin bariyeri (BBB) bozulması10,11,12,tromboliz 13,14,15ve bakteriyel enfeksiyon tedavisi16,17dahil olmak üzere çok aktif bir araştırma alanını temsil ediyor. Bu uygulamaları destekleyen önemli bir fenomen kavitasyondur: sıvı basıncındaki değişikliklere bağlı olarak gazlı boşlukların çekirdeklenmesi, büyümesi ve salınımı18,19.

Kavitasyonun biyolojik etkiler yarattığı bir dizi mekanizma vardır. Örneğin, uygulanan bir ABD alanının etkisi altındaki kabarcık salınımlarının son derece doğrusal olmayan doğası, hem ilaç konveksiyonu20’yi geliştirebilecek hem de kabarcıkların çevresindeki dokuya kesme gerilmeleri uygulayabilecek çevredeki sıvıda mikro akış oluşturabilir. Kabarcıklar bir sınırın yakınında olduğunda, kabarcıkların küresel olmayan salınımlara neden olduğunda ve kesme kaynaklı permeabilizasyon 21,22,23,24yoluyla ilaç alımını potansiyel olarak teşvik edebilir. Daha yüksek basınçlarda, daha büyük genlik salınımları ve hızlı kabarcık çökmesi gözlenir, doğrudan mekanik stres25 verir ve sık sık şok dalgaları üretir ve bunun sonucunda dokuları bozabilen ve permeabilize edebilecek büyük basınç gradyanları26,27. Kabarcıkların bir yüzeye yakın çökmesi, yüksek hızlı sıvı mikrojetlerin28 , 29,30oluşumuna da neden olabilir. Bu mikro jetler dokuya nüfuz edebilir, potansiyel olarak gözenekler oluşturabilir veya ikincil stres dalgaları31,32’yiindükleyebilir. Hem doku hem de hücresel düzeyde biyolojik membranların permeabilizasyonu, öncelikle cilt geçirgenliğinde ABD kaynaklı geliştirme bağlamında kullanılan sonophoresis33,34ve sonoporasyon olarak adlandırılır, esas olarak membran gözeneklerinin oluşumu nedeniyle hücresel zarın ters çevrilebilir permeabilizasyonunu tanımlamak için kullanılır35,36.

Salınımlı kabarcığı hemen çevreleyen sıvıdaki viskoz emilim önemli bir ısıtma etkisi yaratabilir37. Ayrıca, son derece doğrusal olmayan salınımlar, sürüş ABD alanından daha yüksek frekanslarda akustik radyasyon üretir. Bu, çevre dokuda emilimin artmasına ve daha fazla ısınmaya yol açar38. Kabarcık çöküşüne, kabarcık çekirdeğindeki geçici yüksek sıcaklıklar ve basınçlar nedeniyle, sonoluminesans32olarak bilinen yüksek reaktif türlerin ve elektromanyetik radyasyonun üretimi gibi kimyasal etkiler de eşlik edebilir. Bu etkiler, doğum39 için ilgili hücresel yolların potansiyel hasarını ve/veya aktivasyonunu değerlendirmek için araştırılmış ve sonodynamik tedavi40 , 41 , 42,43olarak bilinen bir yaklaşımda ışığa duyarlı ilaçların lokal aktivasyonunda yararlanılmıştır.

Birçok ABD aracılı biyoeffect sadece ABD alan parametrelerinin kontrolü yoluyla başlatılabilir (basınç genliği, frekans, nabız uzunluğu ve tekrarlama sıklığı ve maruz kalma süresi), ancak biyolojik dokuda güvenilir bir şekilde kavitasyon üretmek genellikle yüksek giriş enerjileri gerektirir ve bu nedenle yüksek hasar riski taşır. Eksojen veya yapay kavitasyon çekirdeklerinin tanıtılması, yukarıda tartışılan geniş etki yelpazesini üretmek için gereken girdi enerjisini önemli ölçüde azaltabilir ve sadece ABD ile mümkün olmayabilecek ek etkiler ortaya çıkarmaktadır. Kavitasyon çekirdekleri gaz kabarcıklarıiçerir 26,44, sıvı damlacıklar45,46,47 ve katı parçacıklar48,49,50, nano ölçekli kavitasyon çekirdekleri uzun dolaşım süresi, geliştirilmiş ekstravazasyon ve uzun kavitasyon aktivitesi açısından yararları için acil bir araştırma alanıdır49,51,52,53.

En sık kullanılan çekirdekler, başlangıçta tanısal görüntülemede kontrast ajanları olarak kullanılan gaz mikrobubbles (MB) ‘dir. Tipik olarak 1-2 mikrometre çapındadırlar ve çevredeki ortamda düşük sulu çözünürlüğe sahip yüksek moleküler ağırlıklı bir gaz çekirdeği içerirler. Çekirdek, en yaygın olarak fosfolipidlerden oluşan koruyucu bir lipit, protein veya polimer kabuk ile çevrilidir54. Bir ABD alanına maruz kaldığında, MBs’lerin sıkıştırılabilirliği hacimsel salınımlara maruz kalmalarına neden olur, sonuç olarak MBs’nin kontrast maddesi olarak başarısından sorumlu olan güçlü akustik saçılma üretir. Belirtildiği gibi, bu salınımlar ayrıca terapötik uygulamalarda yararlanılabilen yukarıda belirtilen mekanik, termal ve kimyasal etkilere yol açar. MB kaplama işlemi ayrıca MB yapısı içinde ilaçların kapsüllenerek MB yüzeyine ilaç ve/veya hedefleme türleri takılması için bir mekanizma sunar. Bu teknik, sistemik toksisiteyi azaltmak için ilaçların tetiklenen salınımını kolaylaştırır55. Ayrıca son zamanlarda MB yüzeyinden malzemenin biyolojik yapılara aktarılabileceği ve “sonoprinting”56 , 57,58.

ABD aracılı kavitasyon aktivitesinin izlenmesi, hem in vitro hem de in vivo olarak ortaya çıkan biyolojik etkiler hakkında içgörüler sağlayabilir ve potansiyel olarak bu etkilerin ayarlanmasına ve optimizasyonuna izin verir. Kavitasyon aktivitesini izlemek için en yaygın uygulanan iki yöntem şunlardır: i) ultra yüksek hızlı video mikroskopisi kullanan ve genellikle in vivo olarak mümkün olmayan optik; ve ii) salınımlı ve/ veya çöken kabarcıklar tarafından üretilen yeniden yayılan ses alanlarını kaydeden akustik. Akustik sinyalin hem genlik hem de frekans bileşenleri kabarcık davranışı hakkında bilgi içerir. Düşük olayda düşük kabarcık konsantrasyonları ABD genliklerinin ağırlıklı olarak harmonik emisyonlar ürettiği gösterilmiştir (sürüş frekansının tamsayı katları)59. Sürüş basınçları arttıkça, kabarcık emisyon spektrumu, daha güçlü doğrusal olmayan davranışı gösteren subharmonikler ve ultraharmonik60 olarak bilinen fraksiyonel bileşenlerin yanı sıra atalet kavitasyonunun göstergesi olan geniş bant gürültüsü de içerebilir. Tamsayı harmonikleri kabarcık salınımının birincil göstergesidir, ancak deneysel bir sistemin herhangi bir yerindeki doğrusal olmayanlardan da kaynaklanabilir, örneğin doğrusal olmayan yayılma nedeniyle. Bunun aksine, fraksiyonel harmonikler ve geniş bant gürültüsü kabarcık dinamikleri ile çok güçlü bir şekilde ilişkilidir.

Kabarcık davranışı ve tespit edilen akustik emisyonlar arasındaki ilişki, olay ABD alanı, çekirdeklenme ortamı ve algılama yolunun özellikleri dahil olmak üzere faktörlerle karmaşık olabilir60. Bununla birlikte, kabarcık davranışı ve hücrelerle etkileşimleri hakkında önemli bilgiler, akustik spektrumdaki frekans ve enerji eğilimlerinin ayırt edilmesiyle elde edilebilir. Bu veriler, klinik tedavi izleme tekniklerinin temelini oluşturmak için kullanılabilecek değerli bilgiler de sağlayabilir. Bu bilgilerden tam olarak yararlanmak için sağlam, çevrilebilir ve tekrarlanabilir deneysel yöntemlerin geliştirilmesi gerekir.

Şu anda, kavitasyon destekli tedavilerin geliştirilmesini desteklemek için sistemlerin tasarlanması ve çalışmaların yürütülmesi için bildirilen protokollerde önemli farklılıklar vardır. Cihaz açısından bir dizi tasarım yaklaşımı üstlenilmiştir. Çeşitli gruplar, özel olarak inşa edilmiş veya ticari olarak kullanılabilen paralel plaka odaları56,61, 62,63‘ü kullanmıştır (örneğin, OptiCell, ThermoFisher Scientific). Hu ve arkadaşları (2013), ABD sonication modülü ve gerçek zamanlı konfokal görüntüleme64, Carugo ve diğerleri ile birleştirilmiş bir hücre odası geliştirdi. (2015), ABD maruziyeti sırasında bir su banyosunda batırmaya izin vermek için özel yapım PDMS kapaklı ticari olarak mevcut bir hücre kültürü çanağı içeren bir sistem kullandı65ve Pereno ve ark. (2018), kabarcık dinamiklerinin ve kabarcık hücresi etkileşimlerinin eşzamanlı optik ve akustik karakterizasyonuna izin veren katmanlı akostofluidik rezonatörlerden oluşan bir cihaz kullandı66. Özel olarak üretilmiş ve uygulamaya özgü tasarımların kullanılması, ABD alanının ve diğer çevresel maruz kalma koşullarının karakterizasyonunu zorlaştırarak çapraz çalışma karşılaştırmalarını zorlaştırmaya neden oluyor. Örneğin, 0,02 ila 15 MHz arasında değişen merkez frekansları, %1’den sürekli dalgaya değişen görev döngüleri ve 0,1 ila20 MPa23,64 , 67 , 68,69,70( Tablo1)arasında değişen nadir eylemel basınçları içeren başarılı sonoporasyon elde etmek için tanımlanan ABD parametrelerinde önemli farklılıklar vardır. Spektral bileşenlerde (harmonikler, alt harmonikler vb.) belirli biyoeffekslerle ilişkili olduğu tespit edilen benzer şekilde önemli farklılıklar vardır.

Bu nedenle, bu çalışmanın amacı, kavitasyon kaynaklı hücresel biyoeffekslerin in vitro çalışması için kavitasyon izleme yeteneğinin özel olarak dahil edilmesiyle kolayca tekrarlanabilir bir sistem tasarımı ve uygulama çerçevesi sağlamaktır.

Protocol

1. Sistem Tasarım İlkeleri NOT: Bu bölümde, ABD’de maruz kalma ve kavitasyon izleme sistemleri oluşturmak için kullanılan tasarım ilkeleri sunulmaktadır. Bu ilkeler akustik transfeksiyon için mevcut iki sistemle (SAT) gösterilmiştir (Şekil 1’degösterilmiştir). Her sistem bir hücre maruziyet bölmesi, bir ABD kaynağı ve pasif kavitasyon dedektörü (PCD) olarak işlev gören tek bir eleman dönüştürücüden oluşur ve bunların hepsi bir tezgah üstü test odasına entegre edilmiştir. Bu tasarımlar Carugo ve ark. (2015)65’teaçıklanan önceki sistem geliştirme üzerine inşa edilmektedir. Kullanım kolaylığını en üst düzeye çıkarın. Mevcut ticari hücre kültürü cihazlarını tohumlama/büyüme substratları olarak kullanarak hücre maruziyet bölmesini mevcut kültür teknikleri ve görüntüleme sistemleri ile uyumlu hale getirin. SAT2 için bir kültür çanağı kullanın (21 mm çapında bir alanın gözlemlenebilir olduğu 35 mm çapında, bkz. Malzeme Tablosu). SAT3 için bir Transwell kesici uç kullanın (6,5 mm çapında, bkz. Malzeme Tablosu). Transwell’lerin geçirgen bir zarı vardır ve bu nedenle sudan ziyade hücre ortamına yerleştirilmesi gerekir. Hücre maruziyet bölmesinin hızlı yüklenmesini ve sızdırmazlık sağlar. Kültür çanağının üzerine esnek bir polimer kapak takarak SAT2 hücre maruziyet bölmesini şekillendirin (Carugo ve ark. 201565). Şekil 1C’degörüldüğü gibi, kapak, bölmeyi 18 G künt iğne şırıngası ile doldurmaya izin veren bir çift 1,2 mm çapında delinmeye sahiptir. Doldurduktan sonra, bu dolum bağlantı noktalarını kısa plastik çubuklarla kapatın (Malzeme Masası). SAT3 bölmesini şırınna veya pipetle doldurun ve kauçuk bir durdurucu/bung takarak kapatın. Kapalı hücre maruziyet bölmesinin test odasına hızlı bir şekilde yüklenmesini sağlayın. Hücre maruziyet bölmeleri için tutucular, uygun hizalamayı sağlamak için hafif bir preslemenin yeterli olduğu oda kapaklarına yerleştirilmiştir. Şekil 1’degösterilen sistemlerle, birden fazla hücre maruziyet bölmesi önceden hazırlandığında örnek değişikliklerin süresi 20 saniye kadar kısa olabilir. Sistemin taşınabilir olması ve gerekli su/ortam miktarının en aza indirilebilmesi için hazne iç hacmini en aza indirin. Bunu yapmak aynı zamanda hücre maruziyet bölmesinden yanlışlıkla dökülmelerden veya kavitasyon ajanlarının sızıntılarından iyileşmeyi hızlandırır.NOT: SAT2 iç hacmi yaklaşık 0,8 L’dir. SAT3 dahili hacmi yaklaşık 7,6 L’dir – kaynak dönüştürücüsünü veya konfigürasyonunu kolay yükleme ve değiştirmeyi karşılamak için daha büyük hale getirilir. Tek kullanımlık hacmi en aza indirmek ve tank dolgu suyu (örneğin hücre kültürü ortamı) dışındaki biyolojik olarak ilgili sıvıların kullanılmasına izin vermek için 0,3 L’lik bir iç oda eklendi. İç hazne tabanı, maksimum akustik iletime izin vermek için 30 μm kalınlığında mylar levhadan yapılmıştır. Hazneyi ve iç bileşenleri mümkün olduğunda optik olarak net malzemelerden yapın, böylece herhangi bir sorun (örneğin, sızıntılar, tuzaklı makrobubbles) hızlı bir şekilde gözlemlenebilir ve düzeltilebilir. Pozlama bölmesinin akustik aktarilebilirliğini en üst düzeye çıkarın. Bölme duvar malzemeleri ve kalınlıkları seçenekleriyle aktarılmazlığı en üst düzeye çıkarın. Bir duvarın her iki tarafındaki sıvıların temelde aynı olduğu varsayımı altında (örneğin, su), normal insidans basıncı iletim katsayısı71’in büyüklüğü:, burada kalınlık duvarındaki dalga boyu L , ve zL ve zo sırasıyla duvar malzemesi ve sıvı için karakteristik empedanslardır (yoğunluk ve ses hızı ürünleri). T = 1 mükemmel iletimi gösterir. Kavitasyonun geniş spektrumlu izlenmesi için (örneğin, 1-8 MHz), çoğu laboratuvar polimeri (örneğin, PDMS, PTFE, polistiren), malzemenin kalınlığı malzemedeki dalga boyunun 1/10’undan azsa, iletilen basıncı’dan fazla değiştirmez. Bu durumun yüksek frekanslarda standart sarf malzemeleriyle (örneğin, 8 MHz’de #1,5 kapak kayması) karşılanması zor olabilir, bu nedenle iletim frekansı yanıtını tahmin etmek veya doğrudan kalibre etmek iyi bir uygulamadır. ABD kaynak sinyalinin hücre maruziyet bölmesine dar bant iletimi için, katman malzemesindeki yarım dalga boyunun yaklaşık olarak tamsayı katıysa daha kalın bir katmana izin verin. Örneğin, SAT2’deki PDMS kapağı 2,0 mm kalınlığında kullanılır (~1MHz’de~2 dalga boyu, cPDMS ~ 1000 m/s). Kaynak ve hücre ortamının seçimiyle pozlama bölgesini en üst düzeye çıkarın. Maruz kalan hücre sayısını en üst düzeye çıkarmak için, mevcut kült oluşturma ve görüntüleme ekipmanlarıyla uyumluluğu korurken hücre bağlanma alanını mümkün olduğunca geniş hale getirin. Büyük bir odaklanmış kaynağın (SAT2) ön odak bölgesini veya hücre ek alanının (SAT3) çapıyla eşleşen ana lob genişliğine sahip odaklanmış veya mercekli bir kaynağı kullanarak hücre bağlantı alanını en az uzamsal değişkenlikle kapsayan bir alana sahip bir ABD kaynağı kullanın. Belirli kaynaklar için Malzeme Tablosu’na bakın. Hücre bölmesini olay alanının en güçlü bölümünden uzakta mekanik olarak destekleyerek, tutucunun saçılma kesitini en aza indirerek veya tutucunun üzerine emici malzeme yerleştirerek hücre bölmesi tutucusu tarafından sunulan alan karmaşıklığını en aza indirin. Örnekler Şekil 1A ve 1D’de gösterilmiştir. Tekrarlanabilir pozlama koşullarından emin olun. Kısmen doldurulmuş odalardaki hava-su arayüzlerinden kaynaklanabilecek değişkenliği ortadan kaldırmak için akustik alanı sabit bir sınırda sonlandırın. SAT2 ve 3’te bu, sınır yansımalarından kaynaklanabilecek alan karmaşıklığını azaltmanın daha fazla yararı ile oda kapağına bir akustik emici (bkz. Malzeme Tablosu)takılarak gerçekleştirilir. Küçük değişkenlik veya büyük arızanın hızlı bir şekilde tespit edilebilmesi için amplifikatör çıkışında/kaynak girişte kaynak tahrik voltajını izleyin ve kaydedin. Bir voltaj probu veya tahrik voltajı aralığı üzerinde kullanımı güvenli olan başka bir cihaz kullanın. Dalga biçimi üreteci gibi iyi bilinen bir kaynak kullanarak gerilim probunun kalibrasyonunu periyodik olarak kontrol edin. Odanın sıcaklığını ve içeriğini kontrol edin, izleyin ve kaydedin. Hücrelerin, dönüştürücülerin ve yayılma ortamının yanıtları sıcaklığa duyarlı olabilir. SAT2’de izleme ve kontrol, bir su şartlandırma sistemine bağlı bir çift sirkülasyon bağlantı noktası ile gerçekleştirilirken, SAT3 bir akvaryum ısıtıcısı istihdam eder (gösterilmez). Terapötik uygulama için ilgili fizyolojik koşulları taklit etmek için su sıcaklığını gerektiği gibi ayarlayın.NOT: iç sıcaklıklar hem dış faktörlerin bir sonucu olarak hem de dönüştürücünün ve ortamın ABD tarafından üretilen ısınmasından değişebilir. Yayılma yolunda önceden var olan kabarcıklardan istenmeyen kavitasyon ve/ veya saçılma olasılığını en aza indirmek için oda sıvılarını dikkatlice gazdan arındırın.NOT: Gaz giderme yapılmazsa, örneğin hücreler üzerindeki olumsuz etki nedeniyle, uygun olan kabarcık aktivitesinin gelişmiş bir arka plan seviyesi olacaktır. Tamamen monte edilmiş sistemi kalibre edin. Hücre maruziyet bölmesi de dahil olmak üzere tüm sistem bileşenleri yerindeyken maruz kalan hücreler üzerindeki basınç alanı olayını ölçmenin bir araçlarını ekleyin. SAT2 ve 3’te bu, oda kapağında bir iğne veya fiber optik hidrofonun ölçülecek alanı bozmadan yerleştirilebileceği bir açıklıkla gerçekleştirilir. Ölçümleri hücrelerin bulunduğu yere mümkün olduğunca yakın hale getirin. Hassas yarıçapı(rcv)ölçülen basınç alanını yanlış bildirilmeyecek kadar küçük bir hidrofon seçin. Kabul edilebilir boyut, kaynak frekansı (f) ve yarıçapının (birsrc) yanı sıra kaynak ve alan taraması (zrcv) arasındaki mesafenin bir işlevidir. Hidrofon boyutu seçimi için genel bir kriter: , aşağıdakilere yol açan: , burada c ses hızı72. Hidrofonun, bölüm 1.6’da belirtilen sıcaklık da dahil olmak üzere sistem karakterizasyonunda kullanılan koşullar altında kalibre edildiğine emin olun. Özellikle, hidrofon tarama düzlemine göre bir açıda tutulursa, doğrudanlık etkileri tamamen geometriye dayanarak beklenenlerden önemli ölçüde farklı olabileceğinden, hidrofon bu açıda kalibre edilmelidir. Sıcaklık açısından hidrofon hassasiyetindeki değişiklik üreticiden temin edilmelidir. Hücrelerin açığa çıkabileceği tüm bölgeyi tarayın. Uygun düzeyde alan ayrıntısı yakalamak için, en yüksek ilgi sıklığında dalga boyunun1/5’inden daha kaba olmayan bir tarama aralığı kullanın. Beklenmeyen alan karmaşıklığı gözlenirse, doğrudan ve dağınık alan katkılarının tanımlanmasına ve nicelleştirilmesine izin vermek için kısa patlama sinyalleri (örneğin, 1-3 döngü) kullanmayı düşünün. Kavitasyon izleme yeteneğini dahil edin. İzleme dönüştürücü tipini ve yerleşimini bir güçlendirme olarak değil, genel sistemin tasarımının bir parçası olarak belirleyin. Uygulamada bu, kritik sistem bileşenlerini güvenilir bir şekilde hizalama yeteneğiden ödün vermeden maksimum kompakt bir sisteme yol açar. Sisteme, en az kurulum süresi veya iş akışına rahatsızlık veren bir şekilde tekrarlanabilir şekilde kavitasyon izleme cihazı yerleştirin. SAT2’de bu, oda kapağına takılan bir PCD görevi gören tek elemanlı piezoelektrik dönüştürücü ile gerçekleştirilir, SAT3 ise PCD’yi 90° reflektör kullanarak kaynak tabana entegre eder. Deneylerin amaçlarına göre PCD şeklini seçin. Şekil 2’de,odaklanmamış (sol) ve odaklanmış (sağ) cihazların yarı genlik konturlarının hesaplamaları, frekansa göre mekansal hassasiyetteki derin farklılıkları göstermektedir. Odaklanmamış cihaz, frekansa göre mütevazı uzamsal varyasyona sahip büyük hacimli izleme için daha uygundur, odaklanmış cihaz ise ilgi frekanslarında daha radyal olarak kompakt ölçümler için daha uygundur. Denemenin ihtiyaçlarına uyacak şekilde PCD merkezi frekansını ve bant genişliğini seçin. Merkez frekans, doğrudan kaynak emisyonlarına duyarlılığı en aza indirmek için genellikle ABD kaynağının en az beş katı olarak seçilir. Bant genişliği genellikle çok çeşitli kabarcık davranışlarını (harmonik ve geniş bant gürültüsü) gözlemlemek için en üst düzeye çıkar. Bir sonraki bölümde açıklandığı gibi kavitasyon verilerinin analizine izin vermek için koşullandırma, kayıt ve işleme yöntemlerini seçin. 2. Kavitasyon İzleme için Enstrümantasyon ve İşleme NOT: Bu bölüm, kavitasyon izleme verilerinin toplanması için önerilen sinyal akışı bileşenlerini ve işlevlerini ve kavitasyon aktivitesinin nitel ve nicel değerlendirmelerine yol açan veri işlemeyi sunar. Enstrümantasyon (Ayrıca bkz. Şekil 3). Uygulama özelleştirilmiş bir cihaz çağırmadıkça, genellikle batık hedeflerin tahribatsız testleri için pazarlanan çok çeşitli ticari olarak kullanılabilen tek eleman dönüştürücülerinden bir PCD seçin. Bu tedarikçiler ayrıca kablolama ve aksesuarlara (örneğin, SAT3’teki ayna reflektörü) sahiptir. ABD kaynağına PCD yanıtını en aza indirin. Bu, hem PCD seçimi (merkez frekansı ve bant genişliği) hem de bir çentik veya yüksek geçiş filtresi kullanılarak yapılabilir. İkincisi, bağımsız bir modül olarak veya bir sinyal koşullandırma cihazının parçası olarak uygulanabilir. Yüksek sinyal kırpma ve en küçük sinyallerin gürültü oranına (SNR) maksimum sinyal olasılığıyla mümkün olduğunca fazla veri yakalamak için geniş dinamik aralıklı (en az 12 bit) bir sayısallaştırıcı kullanın. Cihazları karşılaştırırken, elde edilebilir dinamik aralığın daha eksiksiz açıklamaları olduğundan, sinyalden gürültüye ve bozulmaya ve/veya etkili bit sayısına ilişkin teknik özellikleri gözden geçirin. Ayrıca, bellek arabelleği boyutunun istenen uzunluk ve veri yakalama hızı için yeterli olup olmadığını da göz önünde bulundurun. Sayısallaştırıcının dinamik aralığının kullanımını optimize edin. PCD sinyalleri, hem uzun süre maruz kalma (kabarcıklar ortadan kaldırıldıkça) hem de farklı ABD sürücü seviyelerinde deneyler çalıştırmak nedeniyle çeşitli büyüklük sıralarını kapsayabilir. Bu nedenle, sinyal koşullandırma zincirinin tüm sinyalleri düzgün bir şekilde kaydedilebilmesi için ölçeklenerek ölçeklendiğini kontrol etmek gerekir. Beklenen en küçük sinyallerin yeterince yakalanabilmesi için sinyal zincirine bir önbaklazıcı ekleyin. Deneyimlerimize göre, PCD kendi kendine gürültü çoğu dijitalleştiricinin çok altındadır, bu nedenle mütevazı bir önamplifikasyon derecesi (örneğin, <100x) nihai sonucun SNR'sını hala geliştirebilir. Amplifikatörün doygunluğunu önlemek için ön ampliplifikasyondan önce ABD kaynak frekansını filtreleyin. Kazanç ve/veya filtreleme yetenekleri sağlamak için bir ABD darbeci/alıcısı kullanılıyorsa, yol uzunluğunu/hizalamasını onaylamak için darbe modunda kullanın veya PCD ile hücre maruz kalma bölmesi arasındaki yayılma yolunda beklenmeyen saçılmaları kontrol edin. Verilerin depolama alanına gerçek zamanlı akışını etkinleştirin. SAT2 ve SAT3 sistemlerinin her ikisi de taşınabilirlik kolaylıklarına ve iyi inşa edilmiş kullanıcı arayüzlerine sahip 12 bit akışlı USB osiloskoplar (bkz. Malzeme Tablosu)kullanmaktadır. Kazanç veya bant genişliği hatalarını önlemek için sinyal zincirinde uygun empedans eşleştirmesini onaylayın. PCD cihazları tipik olarak 50 ohm’a yakın çıkış empedansına sahiptir, bu nedenle uygun bir işlem PCD’yi bir dalga biçimi üreticisinden bilinen bir sinyalle (50 ohm çıkış empedansı ile) değiştirmek ve sayısallaştırıcıda görünen sinyal boyutunun beklentilerle eşleştiğini onaylamak, enjekte edilen sinyal değiştirildiğinde doğrusal olarak ölçeklenir ve en büyük ilgi sinyali için kırpma gözlenmez. Ön işleme İlgi frekans aralığındaki verilerin işlenmesiyle ilgili sinyal yolundaki bilinen tüm kazançlar ve hassasiyetler için ham voltaj sinyallerini düzeltin. Veriler DC giriş bağlantısıyla kaydedilmişse veya başka bir şekilde DC uzaklığı gösteriyorsa, bu uzaklığı doğrudan çıkarma veya yüksek geçiş filtresiyle kaldırın. Kaydedilen her sinyalin güç spektrumu P’yi hesapla. Fourier dönüştürme uzunluğu Nft’yi, ABD’deki f0 kaynağının temel frekansı dönüştürme kutusu genişliğinin büyük bir tamsayı katı olacak şekilde ayarlayın: Nft =   nfs/f0, burada n tamsayıdır ve fs dijitalleştirilmiş verilerin örnek frekansıdır. Spektral özelliklerin net bir şekilde yakalanması için n ≥ 50’yi ayarlayın. 50 MHz’de örneklenmiş 1 MHz temel örneği için, Nft 2500 ve depo gözü genişliği 0,02 MHz’dir. Dönüşüm uzunluğu Nft genellikle kaydedilen sinyalin süresinden daha küçük olduğundan, Welch’in yöntemi73gibi bir güç spektral yoğunluğu (PSD) tahmin edicisi kullanın. f1-f 2’ye yayılan bir frekans bandındaki güç , burada dF dönüştürme kutusu genişliğidir. Her pozlama sırasında kabarcık aktivitesini karakterize etmek için, güç spektrumu için katkıları f0’ın tamsayı katlarından (harmonikler), f 0 /2’nintek tamsayı katlarından (ultraharmonik) ve geniş bant gürültüsünden (ataletsel kavitasyon) tahmin edin. Harmonik ve ultraharmonik içerik en basit şekilde belirli frekanslarda güç spektrumu değerleri seçilerek tahmin edilir. Bununla birlikte, büyük genlikli ton yanıtları az sayıda bitişik frekans kutusuna (örneğin f0 ± 2-3) yayılabilir, bu nedenle bunlar dar bant güç hesaplamalarına dahil edilmeli ve geniş bant hesaplamalarının dışında tutulmalıdır. Toplam güç spektrumundan harmonik ve ultraharmonik katkıları çıkararak geniş bant bant kavitasyon gücünü tahmin edin. Alternatif olarak, bu katkılar daha karmaşık ön işleme kullanılarak tahmin edilebilir74. Kümülatif kavitasyon sinyal enerjisini maruz kalma süresi boyunca, tercihen spektrum özelliğine / kabarcık aktivite tipine göre tahmin edin. Tüm veri kayıtlarının eşit süreyesahip olduğunu varsayarsak T r , kaydedilen verilerdeki kümülatif enerji , burada M kayıt sayısını gösterir. Kayıtlar arasında boşluklar varsa, pozlama sürekli olduğunda olabileceği gibi ve kaydedilen dosyalar toplam pozlama süresinin bir kısmını yakalarsa Te, kümülatif enerji şu şekilde tahmin edilebilir: Spektrum seviyelerinin ABD’nin yokluğunda kaydedilen arka plan gürültüsüyle karşılaştırılmasıyla ölçüm SNR’sını tahmin edin. 3. Deneysel Protokol SAT Hazırlığı Dolgu sıvısını (tipik olarak filtrelenmiş su) -105 Pa basınç altında en az iki saat boyunca gazdan arındırarak yayılma yolunda kavitasyon olasılığını en aza indirin. Çözünmüş bir oksijen probu ile oksijenin kısmi basıncının 10 kPa’nın altında olduğunun onaylanması önerilir. Gazdan arındırılan sıvıya havanın yeniden girişini en aza indirmek için test odasını yavaşça doldurun. Gerekirse dolu odayı gazdan arındırma devam edin. Doldurmadan hemen sonra ve maruz kalma deneylerini başlatmadan hemen önce dönüştürücü ve ortam kabı yüzeylerindeki tüm artık kabarcıkları temizleyin. Maruz kalma deneylerine başlamadan önce haznenin sıcaklığının ve içeriğinin dengelenmiş olduğundan emin olun. ABD kaynak güç amplifikatörünün ısınmasına izin verin (üretici tavsiyesine göre) böylece kazanç ve çıkış zamana göre kararlı olur. Pozlama Bölmesi Hazırlama Kavitasyon maddesi süspansiyonu Kavitasyon maddesini seyreltirken, makrobubbles’ı kapatmadan veya ajanı yok etmeden (özellikle kabuklu kabarcıklar ise) düzgün bir süspansiyon yapmak için hafifçe ve sürekli karıştırın. MB’lerle çalışırken, yükleme işlemi sırasında tahribatı en aza indirmek için mevcut en büyük gösterge iğnesini kullanarak yavaşça çekin ve dağıtın75. SAT sistemlerinde düzenli olarak 18 G künt dolgu iğnesi kullanılmıştır. SAT2 Hazırlığı Canlı hücrelerle yapılan deneylerde kullanmadan önce PDMS kapağını sterilize edin. PDMS kapağını kültür kabına takarak hücre maruziyet bölmesini oluşturur. 18 G künt iğne ile bir şırınga hazırlayın ve yaklaşık 10 mL sıvı (örneğin, MB süspansiyon veya su kontrolü) ile doldurun. İğneyi PDMS dolgu deliklerinden birine yerleştirin ve makrobubbles’ın açık doldurma deliğinden kaçabilmesi için eğilerek hazneyi yavaşça doldurun. En iyi sonuçları elde şekilde, odayı açık deliğin dolgu deliğinin üzerinde olacak şekilde eğin. Doldurulduğunda, kısa (4-5 mm) bir polimer çubuk yerleştirerek açık deliği kapatın. Montajı her iki delik de yatay olacak şekilde ayarlayın. Ekstra sıvı enjekte ederken künt dolum iğnesini çıkarın, böylece hava çekilmez. Deliği başka bir polimer çubukla kapatın. Bu işlem hücre maruziyet bölmesinin sızdırmazlık işlemini tamamlar. Bölmede tuzaklı makrobubbles kanıtı olup olmadığını görsel olarak kontrol edin ve varsa 3.3.3.-3.3.6’yı tekrarlayın. Basın, hücre pozlama bölmesini bölme tutucusuna sığdırın. Oda kapağını odanın üzerine yerleştirin. Kapağı yatay açıyla indirmek, makrobubbles’ın batık parçalara (emici, tutucu) dayanmasını engeller. Hücre maruziyet bölmesinin (örneğin, yüzen kabarcıklar veya batan nanopartiküller) yönüne ve bunun hücrelerle temaslarını nasıl etkileyeceğine karar verirken süspansiyondaki parçacıkların yüzdürmeliğini düşünün. Tüm operasyonlarda, hücre büyüme yüzeyinin bükülmesini ve hücrelerin ayrılmasını en aza indirmek için mümkün olduğunca az kuvvet kullanın. SAT3 Hazırlığı Transwell’i yaklaşık 150 μL sıvı (örneğin MB süspansiyon veya su kontrolü) ile doldurun. Transwell’i kauçuk bir fişle dikkatlice kapatarak, taşma sıvılarını temiz bir kağıt havlu veya mendille çıkararak hücre maruz kalma bölmesini şekillendirin. Canlı hücrelerle yapılan deneylerde kullanmadan önce kauçuk fişi sterilize edin. Bölmede tuzaklı makrobubbles kanıtı olup olmadığını görsel olarak kontrol edin ve varsa fişi çıkarın, makrobubbles çıkarın ve 4.4.2’yi tekrarlayın. Basın, hücre pozlama bölmesini bölme tutucusuna sığdırın. Oda kapağını odanın üzerine yerleştirin. Kapağı yatay açıyla indirmek, makrobubbles’ın batık parçalara (emici, tutucu) dayanmasını engeller.NOT: Yukarıda belirtildiği gibi, makrobubbles ABD maruz kalma deneyleri üzerinde tekrarlanamaz ve potansiyel olarak zararlı etkileri çeşitli neden olabilir. En kritik olarak, hücre maruziyet bölmesine sıkışmış makrobubbles PCD yanıtlarına ve amaçlanan tedaviyi temsil etmeyen lokal hücresel biyoeffekslere neden olabilir. ABD denemelerini başlatmadan önce makrobubbles bulmak ve kaldırmak için her zaman tüm sistem bileşenlerini görsel olarak inceleyin. 4. Veri Toplama Kontrol sıvısı (örneğin, gazdan arındırılmış su veya hücre ortamı) ile dolu bir hücre maruziyet bölmesi ile ilk deneyleri yaparak arka plan PCD yanıt seviyelerini belirleyin. Arka plan elektronik gürültü seviyelerini oluşturmak için ABD kaynağını yönlendirmeden PCD verilerini kaydedin. ABD kaynağını planlanan sürücü seviyelerinin tam yelpazesinde sürerken PCD verilerini kaydedin. Bu veriler, akustik yanıtın hangi bölümlerinin daha sonra test edilecek kavitasyon ajanlarıyla ilgisi olmadığını gösterecektir.NOT: Yaygın laboratuvar sıvıları (örneğin, PBS veya hücre ortamı) gazdan arındırılmamışsa orta basınçlarda (örneğin 0,5 MHz’de 0,5 MPa) kavitasyon gösterecektir. Ölçümlere başlamadan önce, süspansiyonun oda sıcaklığıyla termal olarak dengelenerek geçmesi için zaman tanıyın. İnce bir iğne termokupl bu amaç için yararlı olabilir. Deneyleri hem zaman hem de frekans etki alanlarında gerçek zamanlı olarak izleyin. PCD’nin zaman etki alanı izlemesi, sinyallerin geçerli enstrümantasyon ayarları için uygun şekilde boyutlandırılmış olup olmadığını ortaya koymaktadır. Özellikle, sinyal kırpmadan kaçınılmalıdır, çünkü frekans etki alanında çok tonlu harmonik yanıt olarak görünecektir. PCD’nin zaman alan izlemesi, KAVitasyon sinyallerinin ABD kaynağından PCD’ye maruz kalma bölmesine yayılma süresine bağlı olarak beklenenden daha erken görüp görmediğini de gösterir. Bu tür sinyaller görülürse, bu test odasına kavitasyon maddesinin sızdırdığını gösterebilir. PCD’nin frekans etki alanı izlemesi kabarcık davranışının türünü gösterir ve istenen hücre uyaranını (örneğin, harmonik uyarılma için daha düşük sürücü seviyeleri) elde etmek için sürücü seviyelerini gerektiği gibi ayarlamak için kullanılabilir. İlk pozlamaların kaçırılmamasını sağlamak için, ABD kaynak sürücü sinyalini açmadan önce veri toplama işlemini başlatın. Maruz kalmanın beklendiği gibi çalıştığından emin olmak için deney boyunca ABD kaynağını (dalga biçimi üreteci çıkışının aksine) yönlendiren amplifikatör çıkış sinyalini izleyin. Bu ölçüm için yüksek voltajlı bir prob kullanın ve osiloskopun prob zayıflamasını telafi etmek için ayarlı olduğundan emin olun. Bir örneği açığa çıkardıktan sonra, test odasından dikkatlice çıkarın. PDMS kapağını (SAT2)/kauçuk fişi (SAT3) daha sonraki kullanımlara hazırlık olarak çıkarın ve temizleyin. Kültür çanağından (SAT2)/Transwell (SAT3) sonraki analizler için gerektiği gibi aktarın (örneğin, mikroskopi, floresan görüntüleme). Az sayıda maruziyet (örneğin, 3-5) sonra, taban çizgisi kavitasyon sinyallerini (kavitasyon maddesinin yokluğunda) yeniden elde etmek ve oda medyasının kirlenmemiş olduğundan emin olmak için orijinal veri kümesiyle karşılaştırmak iyi bir uygulamadır.

Representative Results

Şekil 4, üç farklı kavitasyon davranışını gösteren zaman ve frekans etki alanı PCD yanıtlarının örneklerini gösterir. Tüm veriler SAT3’te PBS’de 5x seyreltilmiş SonoVue MBs kullanılarak toplandı ve son konsantrasyon ~2 * 107 MBs / ml oldu. Bu bölümdeki tüm örnekler için sıcaklık 19 ± 1 °C idi. ABD’li kaynak, 0.20 (Şekil 4A ve 4B ), 0.30 ( Şekil 4C ve 4D ) ve 0.70 MPa (Şekil 4E ve 4F)olay zirvesi negatif basınçlarını elde etmek için0.5 MHz’de 2.0 ms nabız ile sürüldü. Sinyal kayıtları, ABD nabzının t = 0 başlangıcından önce 1,4 ms başladı. İç izlemeler sinyali kayıtlı (kırmızı) ve kaynaktan hücreye maruz kalma bölmesinden PCD’ye uçuş sırasında ortalanmış bir zaman penceresi için 2 MHz yüksek geçiş filtresi (mavi) ile gösterir. Bu saatten önceki düşük seviyeli yanıt, PCD’nin ABD kaynağının arkasında olduğu yapılandırmalarda yaygın olan doğrudan kaynaktan alınan radyasyondan kaynaklanmaktadır. En düşük olay basıncında, PCD yanıtı tamamen 0,5 MHz temel ABD frekansının tamsayı harmoniklerinden oluşur. 0,20’den 0,30 MPa’ya yükseltilmesi, spektrumda belirgin ultraharmoniklerin daha da yükselmesine ek olarak integer harmoniklerine neden olur. 0.30 MPa sonuçları darbe süresi üzerinde daha fazla değişkenlik gösterse de, bu iki basınçta zaman etki alanı dalga şekilleri benzer görünüyor. En yüksek basınçta, zaman etki alanı dalga biçimi genliği, spektrumda açıkça yüksek geniş bant gürültüsünün bir sonucu olarak düşük basınçlara göre doğrusal olarak artmıştır. Bu gürültü genellikle ataletsel kavitasyonun bir sonucu olarak kabul edilir ve bu örnekte MB’lerin yok edilmesine karşılık gelir. Bunu daha net görmek için, pcd yanıtları zamanın bir işlevi olarak Şekil 5. Sol panelde (Şekil 5A), tam spektrumlu tam spektrum, kaynağın her 0,20 saniyede bir 2,0 ms darbe yaydığı 50 saniyelik bir pozlama süresi boyunca gösterilir. İlgili toplam, harmonik ve geniş bant güçleri sağ panelde gösterilmiştir (Şekil 5B). ABD t =3.0 sn’de açıldı ve bu sırada büyük genlikli geniş bant yanıtları görüldü. İlk ani yükselişin süspansiyondaki en büyük kabarcıkların yok edilmesine karşılık geldiği düşünülmektedir (SonoVue polidispersedir) ve kabuklu kabarcıklarla ve hatta gazsız ortamlarla (örneğin, PBS) kavitasyon deneylerinde yaygın bir gözlemdir. Birkaç saniye sonra, geniş bant tepkisi hızla azaldı, görünüşe göre kabarcık tahribatı nedeniyle ve sinyal ağırlıklı olarak harmoniklerden oluşuyor. Bu, serbest bırakılan gazın ve kalan MB’lerin titreştiğini ve inertially olmadığını göstermektedir. T ~ 50’lerde, geniş bant bileşeni orijinal arka plan gürültüsü seviyesine düştü. Bu nedenle, farklı kabarcık etkilerinin odadaki hücrelere etki edebileceği zaman ölçeklerini anlamaya çalışırken bu tür maruz kalma testleri önemlidir. Kabarcıkların, ABD maruziyeti sırasında üretilen radyasyon kuvvetlerine yanıt olarak çevrilmesi muhtemeldir ve MB’lerin PCD görüş alanına girip çıkması, özellikle seyreltilmiş süspansiyonlarla uğraşırken, izlenen kavitasyon sinyalinde değişkenliğin artmasına neden olabilir. Bu nedenle PCD’nin hassas bölgesi, hücre maruziyeti yüzeyinin mümkün olduğunca fazlasına yayılmalıdır. Aynı merkez frekanslarına sahip odaklanmış ve odaklanmamış PCD’lerin karşılaştırması Şekil 6’dagösterilmiştir , normal PBS’de 20:1’lik bir MBs seyreltmesi SAT2’dir. Paneldeki zaman ve örnek ortalamalı spektrum şekil 6A, odaklanmamış PCD’nin hem harmonik (Şekil 6B) hem de ultraharmonik güçlerde ( Şekil6C)azaltılmış örnek-numune değişkenliği eşliğinde daha güçlü bir geniş bant tepkisi içerdiğini göstermektedir. Tüp bebek çalışması için kullanılan medyanın gazdan arındırılmış olmadığını ve kabarcık aktivitesinin gelişmiş bir arka plan seviyesini sunabileceğini bilmek önemlidir. Şekil 7, tedarikçi tarafından sağlanan formda kullanılan PBS’nin SAT2’sinde ve vakum altında iki saat gazdan arındırıldıktan sonra, hava doygunluğunun optik sensörle (PreSens, Almanya) belirlendiği gibi% 92’den% 46’ya düşürüldüğünü göstermektedir. Şekil 7A’daki spektra, maruz kalma süresi ve beş bağımsız örnekle tekrarlar üzerinde ortalama alındı ve normal PBS’de açıkça yüksek ultraharmonikler gösterdi. Üç harmonik üzerinde toplanmış güçler (Şekil 7B) her deneysel çıktının standart sapması içindedir. Buna karşılık, Şekil 7C’deki ultraharmonik toplamlar, normal PBS’nin neredeyse daha yüksek bir boyut sırasına ve numuneler arasında önemli ölçüde daha yüksek değişkenliğe sahip olduğunu göstermektedir. Bu örnekler, hücre uyumlu ortak bir ortamın MB’lerin varlığına (yanlış) atfedilebilecek davranışlar gösterebileceğini gösterir. Hücreler ve/veya kavitasyon ajanı stabilitesi üzerindeki olumsuz etki nedeniyle genellikle gazsız kültür ortamına pratik olmadığından, kavitasyonla ilgili herhangi bir çalışmada uygun kontrollerin yapılması kritik öneme sahiptir. Şekil 1: Kavitasyon izlemeyi içeren iki ABD maruz kalma sistemi tasarımının çizimleri: SAT3 (D-F). (A) Netlik için yan duvar kaldırılmış SAT2 açıklamalı montaj. (B) YAN duvar sağlam SAT2. (C) SAT2 hücre maruz kalma bölmesi, sökülmüş. (D) SAT3 açıklamalı montaj. (E) SAT3 normal (solda) ve farklı frekanslarda eşleşen ışın genişliği için mercekli (sağ) konfigürasyonlar. (F) SAT3 hücre maruz kalma bölmesi, sökülmüş. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 2: 12,7 mm çapında odaklanmamış (sol) ve küresel odaklı (sağ) dönüştürücüler için yarı genlik basınç alanı konturlarının hesaplanması. Koordinat kaynağındaki (0,0) bir PCD öğesi için sırasıyla 2, 4 ve 8 MHz frekansları kırmızı, mavi ve yeşil konturlar olarak gösterilir. Odaklanmamış cihazın en dış konturları frekansa nispeten duyarsızdır, ancak iç yapı frekansa bağlıdır. Küresel olarak odaklanan alan, sıklık arttıkça daralır, ancak konturların içinde alanlar sorunsuz bir şekilde değişir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 3: Kavitasyon sinyali koşullandırma ve kayıt (mavi oklar), ABD kaynak çıkarma (kırmızı çizgiler) ve veri toplama tetikleme için enstrümantasyon. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 4: PBS’de 5x seyreltilmiş MB’lerle kaydedilen zaman (sol) ve frekans (sağ) etki alanı PCD yanıtları. Olay tepe negatif basınçları (A, B) 0.2 MPa, (C, D) 0.4 MPa, (E, F) 0.7 MPa, hepsi 0.5 MHz’deydi. (A, C, E) Zaman etki alanı sinyalleri (kırmızı), tepki düzeyinin olay baskısıyla nasıl değiştiğini gösteren sabit bir dikey ölçekte gösterilir. İç izlemeler sinyali kayıtlı (kırmızı) ve kaynaktan hücreye maruz kalma bölmesinden PCD’ye uçuş sırasında ortalanmış bir zaman penceresi için 2 MHz yüksek geçiş filtresi (mavi) ile gösterir. (B, D, F) Gürültü ve sinyal gücü spektral yoğunlukları sırasıyla t0 için hesaplanır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 5: PBS’de 5x seyreltilmiş MBs süspansiyonunun 50 saniyelik maruziyeti üzerine spektrum geçmişleri. (A) Tam spektrum ve (B) toplam, harmonik ve geniş bant sinyal güçleri, hepsi zamanın bir fonksiyonu olarak. Sürücü koşulları 0.5 MHz, 0.7 MPa tepe negatif basınç, 2.0 ms nabız süresi, 200 ms nabız tekrarı süresiydi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 6: Normal PBS’de mikrobubbles 20:1 seyreltme ile kaydedilen PCD odaklama geometrisinin etkisi. Sürücü koşulları: 1.0 MHz, 0.50 MPa tepe negatif basınç, 3.0 ms nabız süresi, 10 ms nabız tekrarı süresi. (A) Maruz kalma süresi boyunca ortalama tam spektrum ve üç bağımsız örnek tekrarı. (B) 3, 4 ve 5 MHz harmoniklerde güç ve (C) güç 2.5, 3.5 ve 4.5 MHz ultraharmonik. Kalın çizgiler örnek araçlardır, gölgeli alanlar +/- 1 standart sapma gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 7: PBS ile kaydedilen gazdan arındırılmış ortamın etkisi. (A) Maruz kalma süresi boyunca ortalama tam spektrum ve beş bağımsız örnek tekrarı. (B) 3, 4 ve 5 MHz harmoniklerde güç ve (C) güç 2.5, 3.5 ve 4.5 MHz ultraharmonik. Kalın çizgiler örnek araçlardır, gölgeli alanlar +/- 1 standart sapma gösterir. Sürücü koşulları 1.0 MHz, 0.50 MPa tepe negatif basınç, 1.0 ms nabız süresi, 200 ms nabız tekrarı süresiydi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. parametre birim asgari maksimum frekans Mhz 0.02 15 basınç (tepe negatif) Mpa 0.1 20 darbe uzunluğu Döngü 1 Cw görev döngüsü % 1 Cw pozlama süresi S 10 1000 Tablo 1: Sonoporasyon in vitro kolaylaştıran bildirilen parametre aralığının özeti.

Discussion

Herhangi bir akustik ölçüm için kritik adımlar, Apfel tarafından 198176’da “sıvını tanı, ses alanını bil, bir şey olduğunda bil” olarak kapsüllendi. Bu protokol bağlamında, bunlar dönüştürücü kalibrasyon ve hizalama ile su hazırlama ve kabarcık taşıma adımlarını kapsar. İlk olarak, sürüş dönüştürücüslerini ve/veya PCD’yi kalibre etmek için kullanılan hidrofonun, düzenli harici servis veya şirket içi karşılaştırma ile bir referans standardına göre doğru bir şekilde kalibre edilmiş olması önemlidir. Benzer şekilde, çıktıda herhangi bir değişiklik ve/ veya hassasiyet kaybı olup olmadığını kontrol etmek için hem sürüş dönüştürücüsünü hem de PCD’nin yanıtının düzenli olarak karakterize edilmesi gerekir. Sürüş koşulları bilinmiyorsa ve sistemin hassasiyetini alıyorsa, maruz kalma koşulları, biyoeffects ve akustik emisyonlar arasında anlamlı bir ilişki çıkarmak imkansız olacaktır. Bununla doğrudan ilişkili olarak, transdüserlerin birbirine hizalanması ve numune odasının, hazne içindeki maruz kalma koşullarının beklendiği gibi olduğundan ve PCD için örnekleme hacminin ilgi alanına karşılık geldiğinden emin olmak için dikkatlice kontrol edilmesi gerekir. Belirtildiği gibi, askıya alma ortamının sıcaklık ve gaz içeriği nihai sonuçları önemli ölçüde etkileyebilir ve tutarlılık bu açıdan son derece önemlidir77,78. Benzer şekilde, kavitasyon maddesi süspansiyonunun hazırlanması, karakterizasyonu ve işlenmesi, beklenen boyut dağılımının ve parçacıkların konsantrasyonunun numunede mevcut olduğundan emin olmak için çok yakından dikkat gerektirir. Örneğin, kabarcıkların konsantrasyonu çok yüksekse, örnek hacmin olay ABD alanından etkili bir şekilde korunması olacaktır. MB ajanları özellikle yıkıma ve birleşmeye karşı hassastır ve mulvana et’te ele alma konusunda daha fazla rehberlik bulunabilir. al. (2012)79.

Kavitasyon sinyallerinin algılanmasıyla ilgili çok yaygın bir sorun, yeterli bir SNR elde etmektir. Bu kısmen, açıklandığı gibi sinyalin doğasından kaynaklanmaktadır, ancak deneysel kurulumdaki elektriksel gürültü kaynaklarından da kaynaklanabilir. Sistem bileşenleri arasındaki bağlantıların, özellikle de eş eksenel kabloları içeren bağlantıların kontrol edilmesi, bunlardan bazılarının ortadan kaldırılmasına yardımcı olabilir. Ko-eksenel kabloların değiştirilmesi veya onarılması gerekebilir. Laboratuvarda elektrik gürültüsüne neden olabilecek pompalar gibi diğer ekipmanların tanımlanması ve çıkarılması veya devre dışı bırakılması da yardımcı olabilir. Sistem bileşenleri arasındaki zayıf elektrik empedansı, gürültü oranına ve ayrıca ekipmana zarar verme olasılığının daha düşük bir nedeni olabilir ve dikkatlice kontrol edilmelidir. Sinyal oluşturucu ve osiloskop üzerindeki tetikleme ayarları, deneme için uygun şekilde yapılandırıldıklarını ve üreticinin varsayılan ayarlarına geri dönmediklerini onaylamak için benzer şekilde kontrol edilmelidir. Kullanım sırasında kabarcıkların önemli ölçüde tahrip olması durumunda, SAT2 durumunda, çıkış portu için ikinci bir şırınç takmak ve bunu odadan sıvıyı hafifçe çıkarmak için kullanmak ve böylece süspansiyonu çekmek yararlı olabilir. Bu, istenirse makrobubbles ortadan kaldırılmasına veya ABD maruz kalma sırasında akışın etkinleştirilmesine de yardımcı olabilir.

Örnek hazne içindeki akustik yansımaları tamamen ortadan kaldırmak mümkün değildir ve bu nedenle olay alanı tüm numune hacmi üzerinde tamamen düzgün olmayacaktır. 1.3.2 ve 1.3.3. adımlarda belirtildiği gibi, akustik pencerelerin aktarılabilirliği frekansa bağlı olacaktır ve bu nedenle akustik emisyon ölçümleri için istenen bant genişliği dikkatle düşünülmelidir. Özellikle, daha yüksek frekanslı bileşenlerin önemli çoklu yansımaları olabilir. Bu, tamamen monte edilmiş sistem içindeki alanın kalibrasyonunun olay basıncındaki belirsizliği en aza indirmek için bu kadar önemli olmasının bir başka nedenidir. Birden fazla yansımanın etkilerini en aza indirmek için kaydedilen sinyallerin uygun gating’i de düşünülmelidir. Kolaylık sağlamak için ticari cihazların kullanılması ve akustik saydamlık ihtiyacı, bazı optik saydamlıklardan ödün verilmelidir. Bu, örneğin hücre canlılığını veya ilaç alımını değerlendirmek için sonraki görüntüleme kalitesini etkileyebilir. Ticari cihazlarda kullanılan zarların bazıları da gözenekli ve bu nedenle numune odası ile çevredeki su banyosu arasında kusurlu izolasyon meydana gelir. Yukarıda olduğu gibi, ilgili kontaminasyon riski, içeriği düzenli olarak değiştirilebilen daha küçük bir alt oda kullanılarak azaltılabilir. Malzeme Tablosunda belirtilen hücre kültürü cihazları öncelikle tüm ABD/kavitasyon aracılı biyoeffeksler açısından dokuları temsil edemeyen hücre monolayerleri için uygundur. Hücrelerin katı bir yüzeye yakınlığı, MB dinamiklerini, girişte açıklandığı gibi mikro akış ve mikrojetlemeyi teşvik etmek gibi, vivo koşulları yansıtmayacak şekilde de etkileyecektir. Bununla birlikte, bu sınırlamalar alternatif doku modellerinin basit bir ikame edilmesiyle ele alınabilir.

SAT’ları önermekteki amaç, ABD aracılı biyoeffeks çalışmaları arasında akustik maruz kalma koşullarının ve akustik emisyonların tekrarlanabilirliğini artırmak, böylece umarım temel mekanizmaların daha iyi anlaşılmasını ve güvenliği ve etkinliği artırmak için tedavi izleme tekniklerinin geliştirilmesini kolaylaştırmaktır. Sistemler, ticari olarak kullanılabilen hücre kültürü cihazlarıyla uyumlu olacak şekilde tasarlanmıştır, ilgi alanı uygulamasına göre çok çeşitli biyolojik tahlillerin yapılmasını sağlar ve yüksek verim deneylerinin gerçekleştirilmesini sağlayarak, çalıştırmalar arasında zaman alıcı hizalama prosedürlerine olan ihtiyacı ortadan kaldırır. Maruz kalma koşullarının karakterizasyonu ve akustik emisyonların yakalanması için protokoller standartlaştırılarak, sisteme bağımlı değişkenlik umarım azaltılabilir. Belirli bir deney için araştırılması gereken parametre aralığı, uygulamaya (istenen biyo-etki, hücre tipi, in vivo ise hedef doku derinliği vb.) ve kullanılan herhangi bir kavitasyon maddesinin niteliğine bağlı olacaktır. Çok sayıda değişken göz önüne alındığında (ABD frekansı, basınç genliği, darbe uzunluğu, darbe tekrarlama frekansı vb.) tüm parametre alanının tamamen araştırılmasının uygulanabilir olması olası değildir. Önerilen protokolün bir avantajı, bu parametre alanında bazı sınırların hızlı bir şekilde oluşturulmasını sağlar. Örneğin, kavitasyon sinyalinin üretildiği minimum basıncın, hücre kopması/ölümü gerçekleşmeden önce kullanılabilecek maksimum basınç veya darbe uzunluğunun ve fraksiyonel harmoniklerin veya geniş bant gürültüsünün üretildiği basıncın belirlenmesini sağlar. Herhangi bir çalışmada ilk adım olarak bu tür bir kapsam ölçümleri kümesinin yapılması önerilir.

Sunulmuş olduğu gibi, SAT’lar akustik emisyonların gerçek zamanlı izlenmesi için tasarlanmıştır ve deney dışında biyolojik tahliller yapılmaktadır. Bununla birlikte, örnek odanın mikroskop hedefiyle doğrudan optik gözlemini sağlamak için SAT’ı değiştirmek nispeten basit olacaktır. Bu da, örneğin ilaç alımının ve kabarcık dinamiklerinin gözlemlenmesine olanak sağlamak için bir floresan ve/veya yüksek hızlı mikroskopi sistemi ile birleştirilmiş olabilir. Şu anda voltaj açısından sunulan PCD çıkışı şunları gösterir: i) kavitasyon davranışı türleri ve göreceli oranları; ii) bu kavitasyon davranışlarının ne kadar süre devam ettiği; iii) gözlenen zaman kümülatif maruziyet özelliklerinin belirli bir biyoeffekt ile ilişkili olup olmadığı; ve iv) göreli seviyelerin ve zamana bağlı davranışların maruz kalma sistemindeki önceki deneylerle tutarlı olup olmadığı. PCD’nin alma hassasiyeti ölçülebilirken, akustik emisyonları mutlak enerji açısından güvenilir bir şekilde karakterize etmek için ek mekansal bilgiler gereklidir. Bu, PCD’yi pasif akustik haritalama (PAM)80uygulamak için bir dizi probu ile değiştirerek elde edilebilir. Ancak bu, sinyal işlemenin karmaşıklığını ve gereken hesaplama süresini ve gücünü artıracaktır.

Membran elektrik direncinin ölçümü veya manyetik alanlar gibi fiziksel hedefleme yöntemlerinin uygulanması için diğer araçlar da dahil edilebilir. Ayrıca, daha gerçekçi doku ortamlarında ABD ve kavitasyon aracılı etkileri incelemek için hücre monolayerlerinin yerine akustik olarak “yumuşak” jel substratlarında tümör sferoidleri, organoidler ve hatta eks vivo doku örnekleri gibi üç boyutlu doku yapıları kullanmak da mümkündür.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Yazarlar, bu çalışmayı HIBE EP/L024012/1 aracılığıyla desteklemektedir. VB ayrıca Mühendislik ve Fizik Bilimleri Araştırma Konseyi (EPSRC) ve Tıbbi Araştırma Konseyi (MRC) (grant EP/L016052/1) tarafından da desteklenmektedir. VB ve AV, Clarendon Lisansüstü Burslar Vakfı’na teşekkür ediyor. AV ayrıca Exeter College’a Santander bursu için teşekkür ediyor. Yazarlar, james fisk ve david salisbury’ye cihazın üretimindeki paha biçilmez yardımları için borçludur. Ayrıca Dr. Dario Carugo ve Joshua Owen’ın daha önceki prototip SAT’ların geliştirilmesindeki katkılarını da minnetle kabul ediyorlar.

Materials

Absorber Precision Acoustics APTFlex F28 panel 1.0 cm standard thickness
Amplifier (power) E&I Ltd. 1040L 400W power amplifier to drive ultrasound source
Amplifier (pre) Stanford Research Systems SR445A Fixed gain multi-stage preamplifier for PCD signals
Aquarium heater Aquael Ultra 50W Different models for different tank sizes.
Digitizer TiePie Engineering HS5-110-XM Extended memory option: 32M points per channel
Hydrophone Precision Acoustics FOH 0.01 mm diameter sensitive area minimises directivity effects
Microbubbles Bracco SonoVue FDA approved microbubbles
PCD mirror (SAT3) Olympus NDT F-102 90 degree beam reflection
PCD transducer Olympus NDT V320-SU Immersion transducer, 7.5MHz
PCD waterproof cable Olympus NDT BCU-58-1 W
PDMS (SAT2 compartment lid) Corning Sylgard 184 See Carugo et al. (2015) for preparation guidelines
Polymer rod (SAT2 seal) Zeus PTFE monofilament
Rubber plug (SAT3 lid/seal) VWR 391-2101 6mm bottom dia., 8mm top dia., red
Signal generator Agilent 33250 Waveform generator for ultrasound source
Substrate for cell exposure compartment, SAT2 Ibidi µ-Dish 35mm
Substrate for cell exposure compartment, SAT3 Corning Transwell 6.5mm
Ultrasound source (SAT3) Sonic Concepts H107 with central hole Use of a HIFU-capable source allows pressures >1MPa to be generated both at the focus and pre-focally for expanded spatial coverage
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Maier, A., Steidl, S., Christlein, V., Hornegger, J. Medical Imaging Systems – An Introductory Guide. Lecture Notes in Computer Science. , (2018).
  2. Tachibana, K., Tachibana, S. Albumin microbubble echo-contrast material as an enhancer for ultrasound accelerated thrombolysis. Circulation. 92, 1148-1150 (1995).
  3. Bao, S., Thrall, B. D., Miller, D. L. Transfection of a reporter plasmid into cultured cells by sonoporation in vitro. Ultrasound in Medicine and Biology. 23 (6), 953-959 (1997).
  4. Price, R. J., Skyba, D. M., Kaul, S., Skalak, T. C. Delivery of colloidal particles and red blood cells to tissue through microvessel ruptures created by targeted microbubble destruction with ultrasound. Circulation. 98 (13), 1264-1267 (1998).
  5. Theek, B., et al. Sonoporation enhances liposome accumulation and penetration in tumors with low EPR. Journal of Controlled Release. 231, 77-85 (2016).
  6. Dimcevski, G., et al. A human clinical trial using ultrasound and microbubbles to enhance gemcitabine treatment of inoperable pancreatic cancer. Journal of Controlled Release. 243, 172-181 (2016).
  7. Snipstad, S., et al. Ultrasound Improves the Delivery and Therapeutic Effect of Nanoparticle-Stabilized Microbubbles in Breast Cancer Xenografts. Ultrasound in Medicine and Biology. 43 (11), 2651-2669 (2017).
  8. Unga, J., Hashida, M. Ultrasound induced cancer immunotherapy. Advanced Drug Delivery Reviews. 72, 144-153 (2014).
  9. Yang, C., Du, M., Yan, F., Chen, Z. Focused ultrasound improves NK-92MI cells infiltration into tumors. Frontiers in Pharmacology. 10, 326 (2019).
  10. McDannold, N., Arvanitis, C. D., Vykhodtseva, N., Livingstone, M. S. Temporary disruption of the blood-brain barrier by use of ultrasound and microbubbles: Safety and efficacy evaluation in rhesus macaques. Cancer Research. 72 (14), 3652-3663 (2012).
  11. O’Reilly, M. A., Hynynen, K. Ultrasound and microbubble-mediated blood-brain barrier disruption for targeted delivery of therapeutics to the brain. Methods in Molecular Biology. 1831, 111-119 (2018).
  12. Mainprize, T., et al. Blood-Brain Barrier Opening in Primary Brain Tumors with Non-invasive MR-Guided Focused Ultrasound: A Clinical Safety and Feasibility Study. Scientific Reports. 9, 321 (2019).
  13. Ebben, H. P., Nederhoed, J. H., Lely, R. J., Wisselink, W., Yeung, K. Microbubbles and UltraSound-accelerated Thrombolysis (MUST) for peripheral arterial occlusions: Protocol for a phase II single-arm trial. BMJ Open. 7, 014365 (2017).
  14. de Saint Victor, M., Barnsley, L. C., Carugo, D., Owen, J., Coussios, C. C., Stride, E. Sonothrombolysis with Magnetically Targeted Microbubbles. Ultrasound in Medicine & Biology. 45 (5), 1151-1163 (2019).
  15. Dixon, A. J., Li, J., Rickel, J. M. R., Klibanov, A. L., Zuo, Z., Hossack, J. A. Efficacy of Sonothrombolysis Using Microbubbles Produced by a Catheter-Based Microfluidic Device in a Rat Model of Ischemic Stroke. Annals of Biomedical Engineering. , (2019).
  16. Horsley, H., et al. Ultrasound-activated microbubbles as a novel intracellular drug delivery system for urinary tract infection. Journal of Controlled Release. 301, 166-175 (2019).
  17. Lattwein, K. R., et al. Sonobactericide: An Emerging Treatment Strategy for Bacterial Infections. Ultrasound in Medicine and Biology. 46 (2), 193-215 (2020).
  18. Crum, L. A., Fowlkes, J. B. Acoustic cavitation generated by microsecond pulses of ultrasound. Nature. 319, 52-54 (1986).
  19. Holland, C. K., Apfel, R. E. Thresholds for transient cavitation produced by pulsed ultrasound in a controlled nuclei environment. Journal of the Acoustical Society of America. 88, 2059-2069 (1990).
  20. Rifai, B., Arvanitis, C. D., Bazan-Peregrino, M., Coussios, C. C. Cavitation-enhanced delivery of macromolecules into an obstructed vessel. The Journal of the Acoustical Society of America. 128, (2010).
  21. Wu, J., Ross, J. P., Chiu, J. F. Reparable sonoporation generated by microstreaming. The Journal of the Acoustical Society of America. 111 (3), 1460-1464 (2002).
  22. Doinikov, A. A., Bouakaz, A. Acoustic microstreaming around a gas bubble. The Journal of the Acoustical Society of America. 127 (2), 703-709 (2010).
  23. De Cock, I., et al. Ultrasound and microbubble mediated drug delivery: acoustic pressure as determinant for uptake via membrane pores or endocytosis. Journal of Controlled Release Official Journal of the Controlled Release Society. 197, 20-28 (2015).
  24. Pereno, V., Lei, J., Carugo, D., Stride, E. Microstreaming inside Model Cells Induced by Ultrasound and Microbubbles. Langmuir. 36, 6388-6398 (2020).
  25. Chen, H., Brayman, A. A., Kreider, W., Bailey, M. R., Matula, T. J. Observations of translation and jetting of ultrasound-activated microbubbles in mesenteric microvessels. Ultrasound in Medicine and Biology. 37 (12), 2139-2148 (2011).
  26. Lentacker, I., De Smedt, S. C., Sanders, N. N. Drug loaded microbubble design for ultrasound triggered delivery. Soft Matter. 5, 2161-2170 (2009).
  27. Song, J. H., Moldovan, A., Prentice, P. Non-linear Acoustic Emissions from Therapeutically Driven Contrast Agent Microbubbles. Ultrasound in Medicine and Biology. 45 (8), 2188-2204 (2019).
  28. Ohl, C., Arora, M., Ikink, R., De Jong, N., Versluis, M., Delius, M. Sonoporation from Jetting Cavitation Bubbles. Biophysical Journal. 91 (11), 4285-4295 (2006).
  29. Li, Z. G., Liu, a. Q., Klaseboer, E., Zhang, J. B., Ohl, C. D. Single cell membrane poration by bubble-induced microjets in a microfluidic chip. Lab on a Chip. 13 (6), 1144-1150 (2013).
  30. Wang, Q. X., Manmi, K. Three dimensional microbubble dynamics near a wall subject to high intensity ultrasound. Physics of Fluids. 26, 032104 (2014).
  31. Suslick, K. S. . Ultrasound: Its Chemical, Physical, and Biological Effects. Radiology. , (1988).
  32. Mitragotri, S. Healing sound: the use of ultrasound in drug delivery and other therapeutic applications. Nature reviews. Drug discovery. 4 (3), 255-260 (2005).
  33. Mitragotri, S. Sonophoresis: Ultrasound-mediated transdermal drug delivery. Percutaneous Penetration Enhancers Physical Methods in Penetration Enhancement. , 3-14 (2017).
  34. Park, J., Lee, , et al. Enhanced Transdermal Drug Delivery by Sonophoresis and Simultaneous Application of Sonophoresis and Iontophoresis. AAPS PharmSciTech. 20 (3), 96 (2019).
  35. Lentacker, I., De Cock, I., Deckers, R., De Smedt, S. C., Moonen, C. T. W. Understanding ultrasound induced sonoporation: Definitions and underlying mechanisms. Advanced Drug Delivery Reviews. 72, 49-64 (2014).
  36. Wawryka, P., Kiełbik, A., Iwanek, G. Microbubble based sonoporation – the basics into clinical implications. Medical Research Journal. 4 (3), 178-183 (2019).
  37. Hilgenfeldt, S., Lohse, D., Zomack, M. Sound scattering and localized heat deposition of pulse-driven microbubbles. The Journal of the Acoustical Society of America. 107 (6), 3530-3539 (2000).
  38. Holt, R. G., Roy, R. A. Measurements of bubble-enhanced heating from focused, MHz-frequency ultrasound in a tissue-mimicking material. Ultrasound Medical Biology. 27 (10), 1399-1412 (2001).
  39. Tan, J., Li, P., Xue, H., Li, Q. Cyanidin-3-glucoside prevents hydrogen peroxide (H 2 O 2 )-induced oxidative damage in HepG2 cells. Biotechnology Letters. 42 (11), 2453-2466 (2020).
  40. Costley, D., et al. Treating cancer with sonodynamic therapy: A review. International Journal of Hyperthermia. 31 (2), 107-117 (2015).
  41. You, D. G., et al. ROS-generating TiO2 nanoparticles for non-invasive sonodynamic therapy of cancer. Scientific Reports. 6, 23200 (2016).
  42. Canavese, G., et al. Nanoparticle-assisted ultrasound: A special focus on sonodynamic therapy against cancer. Chemical Engineering Journal. 340, 155-172 (2018).
  43. Beguin, E., et al. Direct Evidence of Multibubble Sonoluminescence Using Therapeutic Ultrasound and Microbubbles. ACS Applied Materials & Interfaces. 11 (22), 19913-19919 (2019).
  44. Stride, E., et al. Microbubble Agents: New Directions. Ultrasound in Medicine and Biology. 46 (6), 1326-1343 (2020).
  45. Rapoport, N., Gao, Z., Kennedy, A. Multifunctional nanoparticles for combining ultrasonic tumor imaging and targeted chemotherapy. Journal of the National Cancer Institute. 99 (14), 1095-1106 (2007).
  46. Cao, Y., et al. Drug release from phase-changeable nanodroplets triggered by low-intensity focused ultrasound. Theranostics. 8 (5), 1327-1339 (2018).
  47. Zhang, L., et al. Mitochondria-Targeted and Ultrasound-Activated Nanodroplets for Enhanced Deep-Penetration Sonodynamic Cancer Therapy. ACS Applied Materials & Interfaces. 11 (9), 9355-9366 (2019).
  48. Delogu, L. G., et al. Functionalized multiwalled carbon nanotubes as ultrasound contrast agents. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (41), 16612-16617 (2012).
  49. Paris, J. L., et al. Ultrasound-mediated cavitation-enhanced extravasation of mesoporous silica nanoparticles for controlled-release drug delivery. Chemical Engineering Journal. 340, 2-8 (2018).
  50. Mannaris, C., et al. Gas-Stabilizing Gold Nanocones for Acoustically Mediated Drug Delivery. Advanced Healthcare Materials. 7 (12), 1800184 (2018).
  51. Kwan, J. J., et al. Ultrasound-induced inertial cavitation from gas-stabilizing nanoparticles. Physical Review E – Statistical, Nonlinear, and Soft Matter Physics. 92 (2), (2015).
  52. Kwan, J. J., et al. Ultrasound-Propelled Nanocups for Drug Delivery. Small. 11 (39), 5305-5314 (2015).
  53. Mannaris, C., et al. Microbubbles, Nanodroplets and Gas-Stabilizing Solid Particles for Ultrasound-Mediated Extravasation of Unencapsulated Drugs: An Exposure Parameter Optimization Study. Ultrasound in Medicine and Biology. 45, 954-967 (2019).
  54. Roovers, S., et al. The Role of Ultrasound-Driven Microbubble Dynamics in Drug Delivery: From Microbubble Fundamentals to Clinical Translation. Langmuir. 35, 10173-10191 (2019).
  55. Lentacker, I., Geers, B., Demeester, J., De Smedt, S. C., Sanders, N. N. Design and Evaluation of Doxorubicin-containing Microbubbles for Ultrasound-triggered Doxorubicin Delivery: Cytotoxicity and Mechanisms Involved. Molecular Therapy. 18 (1), 101-108 (2010).
  56. De Cock, I., Lajoinie, G., Versluis, M., De Smedt, S. C., Lentacker, I. Sonoprinting and the importance of microbubble loading for the ultrasound mediated cellular delivery of nanoparticles. Biomaterials. 83, 294-307 (2016).
  57. Roovers, S., et al. Sonoprinting of nanoparticle-loaded microbubbles: Unraveling the multi-timescale mechanism. Biomaterials. 217, 119250 (2019).
  58. Carugo, D., et al. Modulation of the molecular arrangement in artificial and biological membranes by phospholipid-shelled microbubbles. Biomaterials. 113, 105-117 (2017).
  59. Stride, E. P., Coussios, C. C. Cavitation and contrast: The use of bubbles in ultrasound imaging and therapy. Proceedings of the Institution of Mechanical Engineers, Part H: Journal of Engineering in Medicine. 224 (2), 171-191 (2010).
  60. Stride, E., Coussios, C. Nucleation, mapping and control of cavitation for drug delivery. Nature Reviews Physics. 1, 495-509 (2019).
  61. Dong, Y., et al. Antibiofilm effect of ultrasound combined with microbubbles against Staphylococcus epidermidis biofilm. International Journal of Medical Microbiology. 307 (6), 321-328 (2017).
  62. Van Rooij, T., et al. Vibrational Responses of Bound and Nonbound Targeted Lipid-Coated Single Microbubbles. IEEE Transactions on Ultrasonics, Ferroelectrics, and Frequency Control. 64 (5), 785-797 (2017).
  63. Duan, X., Yu, A. C. H., Wan, J. M. F. Cellular Bioeffect Investigations on Low-Intensity Pulsed Ultrasound and Sonoporation: Platform Design and Flow Cytometry Protocol. IEEE Transactions on Ultrasonics, Ferroelectrics, and Frequency Control. 66 (9), 1422-1434 (2019).
  64. Hu, Y., Wan, J. M. F., Yu, A. C. H. Membrane Perforation and Recovery Dynamics in Microbubble-Mediated Sonoporation. Ultrasound in Medicine and Biology. 39 (12), 2393-2405 (2013).
  65. Carugo, D., Owen, J., Crake, C., Lee, J. Y., Stride, E. Biologicallyand acoustically compatible chamber for studying ultrasound-mediated delivery of therapeutic compounds. Ultrasound in Medicine and Biology. 41 (7), 1927-1937 (2015).
  66. Pereno, V., et al. Layered acoustofluidic resonators for the simultaneous optical and acoustic characterisation of cavitation dynamics, microstreaming, and biological effects. Biomicrofluidics. 12 (3), 034109 (2018).
  67. Fan, Z., Liu, H., Mayer, M., Deng, C. X. C. X. Spatiotemporally controlled single cell sonoporation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (41), 16486-16491 (2012).
  68. Helfield, B., Chen, X., Watkins, S. C., Villanueva, F. S. Biophysical insight into mechanisms of sonoporation. Proceedings of the National Academy of Sciences. , (2016).
  69. Helfield, B. L., Chen, X., Qin, B., Watkins, S. C., Villanueva, F. S. Mechanistic Insight into Sonoporation with Ultrasound-Stimulated Polymer Microbubbles. Ultrasound in Medicine and Biology. 43 (11), 2678-2689 (2017).
  70. Aron, M., Vince, O., Gray, M., Mannaris, C., Stride, E. Investigating the Role of Lipid Transfer in Microbubble-Mediated Drug Delivery. Langmuir. 35 (40), 13205-13215 (2019).
  71. Kinsler, L. E., Frey, A. R., Coppens, A. B., Sanders, J. V. . Fundamentals of Acoustics, 4th Edition. , (2000).
  72. Wear, K. A. Considerations for Choosing Sensitive Element Size for Needle and Fiber-Optic Hydrophones-Part I: Spatiotemporal Transfer Function and Graphical Guide. IEEE Transactions on Ultrasonics, Ferroelectrics, and Frequency Control. 66 (2), 318-339 (2019).
  73. Stoica, P., Moses, R. . Spectral Analysis of Signals. , (2005).
  74. Lyka, E., Coviello, C., Kozick, R., Coussios, C. C. Sum-of-harmonics method for improved narrowband and broadband signal quantification during passive monitoring of ultrasound therapies. Journal of the Acoustical Society of America. 140 (1), 741-754 (2016).
  75. Barrack, T., Stride, E. Microbubble Destruction During Intravenous Administration: A Preliminary Study. Ultrasound in Medicine and Biology. 35 (3), 515-522 (2009).
  76. Apfel, R. E. Acoustic cavitation. Methods in Experimental Physics. 19, 355-411 (1981).
  77. Mulvana, H., Stride, E., Tang, M. X., Hajnal, J. V., Eckersley, R. J. The Influence of Gas Saturation on Microbubble Stability. Ultrasound in Medicine and Biology. 38 (6), 1097-1100 (2012).
  78. Mulvana, H., Stride, E., Hajnal, J. V., Eckersley, R. J. Temperature dependent behavior of ultrasound contrast agents. Ultrasound in Medicine and Biology. 36 (6), 925-934 (2010).
  79. Mulvana, H., Eckersley, R. J., Tang, M. X., Pankhurst, Q., Stride, E. Theoretical and Experimental Characterisation of Magnetic Microbubbles. Ultrasound in Medicine and Biology. 38 (5), 864-875 (2012).
  80. Coviello, C., et al. Passive acoustic mapping utilizing optimal beamforming in ultrasound therapy monitoring. Journal of the Acoustical Society of America. 137 (5), 2573-2585 (2015).

Tags

Cavitation Enhanced TherapyBench-top System DesignData CollectionAnalysisIn-vitro StudyCavitation MonitoringSample AlignmentCellular AnalysisDrug DeliverySonoporationSonoprintingReproducibilityControlsElectrical NoiseDegassed LiquidDissolved OxygenUltrasound SourceCavitation AgentMicro BubblesSterilizationCell Compartment

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Gray, M., Vasilyeva, A. V., Brans, V., Stride, E. Studying Cavitation Enhanced Therapy. J. Vis. Exp. (170), e61989, doi:10.3791/61989 (2021).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image