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Bioengineering

Studiare la terapia potenziata della cavitazione

Published: April 09, 2021
doi:
10.3791/61989
, , ,
1Institute of Biomedical Engineering,University of Oxford

Summary

Il protocollo sperimentale presentato può essere utilizzato per eseguire misurazioni in tempo reale dell’attività di cavitazione in un dispositivo di coltura cellulare allo scopo di consentire lo studio delle condizioni richieste per il successo della somministrazione di farmaci e/o di altri bioeffati.

Abstract

L’interesse per le applicazioni terapeutiche degli ultrasuoni è significativo e in crescita, con potenziali obiettivi clinici che vanno dal cancro al morbo di Alzheimer. La cavitazione – la formazione e il successivo movimento delle bolle all’interno di un campo ad ultrasuoni – rappresenta un fenomeno chiave alla base di molti di questi trattamenti. Permangono, tuttavia, notevoli incertezze riguardo ai meccanismi dettagliati di azione attraverso i quali la cavitazione promuove gli effetti terapeutici ed è necessario sviluppare tecniche di monitoraggio affidabili che possano essere implementate clinicamente. In particolare, vi è una variazione significativa tra gli studi sui parametri di esposizione segnalati come efficaci per fornire effetti terapeutici e le corrispondenti emissioni acustiche. Lo scopo di questo documento è fornire linee guida di progettazione e un protocollo sperimentale utilizzando componenti ampiamente disponibili per l’esecuzione di studi sui bioeffati mediati dalla cavitazione e includere il monitoraggio acustico in tempo reale. Si spera che il protocollo consentirà un’incorporazione più diffusa del monitoraggio acustico negli esperimenti terapeutici ad ultrasuoni e faciliterà il confronto tra gli studi sulle condizioni di esposizione e la loro correlazione con i bioealiali pertinenti.

Introduction

Gli ultrasuoni (US) sono stati ampiamente utilizzati come tecnica di imaging diagnostico a causa della sua natura sicura e non invasiva, della sua facilità di implementazione al capezzale di un paziente e della sua economicità1. Accanto alle sue capacità diagnostiche e di monitoraggio, gli Stati Uniti hanno un notevole potenziale per le applicazioni terapeutiche. I primi lavori esplorarono il suo uso intrombolisi, La trasfezione del DNA e la somministrazione di farmaci2,3,4 e gli Stati Uniti terapeutici rappresentano ora un’area di ricerca molto attiva, con applicazioni tra cui il trattamento del tumore5,6,7, immunoterapia8,9,la barriera emato-encefalica (BBB) interruzione10,11,12,trombolisi13,14,15e trattamento delle infezioni batteriche16,17. Un fenomeno chiave alla base di queste applicazioni è la cavitazione: la nucleazione, la crescita e l’oscillazione delle cavità gassose a causa dei cambiamenti nella pressionedel fluido 18,19.

Esiste una serie di meccanismi attraverso i quali la cavitazione produce effetti biologici. Ad esempio, la natura altamente non lineare delle oscillazioni delle bolle sotto l’influenza di un campo statunitense applicato può generare microstreaming nel liquido circostante che può sia migliorare la convezionedel farmaco 20 che esercitare sollecitazioni di taglio sul tessuto in prossimità delle bolle. Ciò è particolarmente diffuso quando le bolle si trovano in prossimità di un confine, causando bolle che oscillano non sfericamente, e possono potenzialmente promuovere l’assorbimento di farmaci attraverso la permeabilizzazione indotta da taglio21,22,23,24. A pressioni più elevate, si osservano oscillazioni di ampiezza maggiori e rapido collasso della bolla, che impartiscono sollecitazionimeccaniche dirette 25 e generano frequentemente onde d’urto, e conseguenti grandi gradienti di pressione che possono interrompere e permeabilizzare itessuti 26,27. Il collasso delle bolle vicino a una superficie può anche portare alla formazione di microjet liquidi ad alta velocità28,29,30. Questi microjet possono penetrare nei tessuti, creando potenzialmente pori o inducendo onde di stresssecondarie 31,32. La permeabilizzazione delle membrane biologiche sia a livello tissutale che cellulare è variamente indicata come sonoforesi, utilizzata principalmente nel contesto del miglioramento indotto dagli Stati Uniti nella permeabilità cutanea33,34,e sonoporazione, utilizzata principalmente per descrivere la permeabilizzazione reversibile della membrana cellulare dovuta alla formazione di pori di membrana35,36.

L’assorbimento viscoso nel liquido immediatamente circostante la bolla oscillante può produrre un sostanziale effettoriscaldante 37. Inoltre, le oscillazioni altamente non lineari producono radiazioni acustiche a frequenze superiori al campo guida degli Stati Uniti. Ciò porta ad un maggiore assorbimento nel tessuto circostante e ad un ulterioreriscaldamento 38. Il collasso della bolla può anche essere accompagnato da effetti chimici dovuti alle alte temperature e pressioni transitori nel nucleo della bolla, come la generazione di specie altamente reattive e la radiazione elettromagnetica, nota come sonoluminescenza32. Questi effetti sono stati studiati per valutare potenziali danni e/o attivazione di percorsi cellulari rilevanti per il parto39 e sfruttati nell’attivazione locale di farmaci sensibili alla luce in un approccio noto come terapia sonodinamica40,41,42,43.

Molti bioeffati mediati negli Stati Uniti possono essere avviati esclusivamente attraverso il controllo dei parametri di campo degli Stati Uniti (ampiezza della pressione, frequenza, lunghezza dell’impulso e frequenza di ripetizione e durata dell’esposizione), ma generare in modo affidabile cavitazione nel tessuto biologico richiede spesso elevate energie di input e quindi comporta un elevato rischio di danni. L’introduzione di nuclei di cavitazione esogeni o artificiali può ridurre sostanzialmente l’energia di input necessaria per produrre l’ampia gamma di effetti sopra discussi e introduce ulteriori effetti che potrebbero non essere possibili solo con gli Stati Uniti. I nuclei di cavitazione includono bolle di gas26,44,goccioline liquide45,46,47 e particelle solide48,49,50, con nuclei di cavitazione su scala nanometrica che sono un’area emergente di indagine per i loro benefici in termini di tempo di circolazione prolungato, migliore estravasazione e attività di cavitazioneprolungata 49,51,52,53.

I nuclei più comunemente usati sono le microbolle a gas (MB), originariamente utilizzate come agenti di contrasto nell’imaging diagnostico. Sono tipicamente di 1-2 micrometri di diametro e contengono un nucleo di un gas ad alto peso molecolare con bassa solubilità acquosa nel mezzo circostante. Il nucleo è circondato da un guscio protettivo di lipidi, proteine o polimeri più comunemente costituito da fosfolipidi54. Quando esposti a un campo statunitense, la comprimibilità degli MB li fa subire oscillazioni volumetriche, producendo di conseguenza una forte dispersione acustica, che è responsabile del successo delle MB come agente di contrasto. Come accennato, queste oscillazioni portano anche ai suddetti effetti meccanici, termici e chimici che possono essere sfruttati in applicazioni terapeutiche. Il processo di rivestimento MB offre anche un meccanismo per incapsulare i farmaci all’interno della struttura MB e per attaccare farmaci e / o indirizzare le specie alla superficie MB. Questa tecnica facilita il rilascio innescato di farmaci per ridurre la tossicità sistemica55. Recentemente è stato anche dimostrato che il materiale proveniente dalla superficie MB può essere trasferito in strutture biologiche, migliorando la somministrazione di farmaci attraverso la cosiddetta “sonoprinting”56,57,58.

Il monitoraggio dell’attività di cavitazione mediata negli Stati Uniti può fornire approfondimenti sugli effetti biologici risultanti sia in vitro che in vivo e potenzialmente consente la messa a punto e l’ottimizzazione di questi effetti. I due metodi più applicati per il monitoraggio dell’attività di cavitazione sono i) ottici, che utilizzano la microscopia video ad altissima velocità e non sono generalmente realizzabili invivo; e ii) acustici, che registrano i campi sonori ri-irradiati prodotti da bolle oscillanti e/o collassi. Sia l’ampiezza che la frequenza del segnale acustico contengono informazioni sul comportamento della bolla. Basse concentrazioni di bolle a basse ampiezze degli Stati Uniti incidenti hanno dimostrato di produrre emissioni prevalentemente armoniche (multipli interi della frequenza di guida)59. Con l’aumentare delle pressioni di guida, lo spettro di emissione delle bolle può anche contenere componenti frazionari noti come sottoarmonici e ultraarmonici60 che indicano un comportamento non lineare più forte, così come il rumore a banda larga, che è indicativo della cavitazione inerziale. Le armoniche intere sono un indicatore primario dell’oscillazione della bolla, ma possono anche essere causate da non linearità in qualsiasi punto di un sistema sperimentale, ad esempio, a causa della propagazione non lineare. Al contrario, le armoniche frazionarie e il rumore a banda larga sono fortemente correlati con la dinamica delle bolle.

La relazione tra il comportamento della bolla e le emissioni acustiche rilevate può essere complicata da fattori tra cui il campo statunitense incidente, l’ambiente di nucleazione e le caratteristiche dellavia di rilevamento 60. Tuttavia, importanti informazioni sul comportamento delle bolle e sulle loro interazioni con le cellule possono essere ottenute discernendo le tendenze di frequenza ed energia nello spettro acustico. Questi dati possono anche fornire informazioni preziose che possono essere utilizzate per costituire la base per le tecniche di monitoraggio del trattamento clinico. Per sfruttare appieno queste informazioni, è necessario lo sviluppo di metodi sperimentali robusti, traducibili e riproducibili.

Attualmente vi sono sostanziali variazioni nei protocolli segnalati per la progettazione di sistemi e lo svolgimento di studi a supporto dello sviluppo di terapie assistite da cavitazione. Per quanto riguarda l’apparato, è stata intrapresa una serie di approcci progettuale. Diversi gruppi hanno fatto uso di camere a piastre parallele56,61,62,63,costruite su misura o disponibili in commercio (ad esempio, OptiCell, ThermoFisher Scientific). (2013) ha sviluppato una camera cellulare accoppiata con un modulo di sonicazione statunitense e imaging confocale intempo reale 64, Carugo et al. (2015) ha utilizzato un sistema che comprende un piatto di coltura cellulare disponibile in commercio con un coperchio PDMS su misura per consentire l’immersione in un bagnod’acqua durante l’esposizione statunitense65e Pereno et al. L’uso di design personalizzati e specifici dell’applicazione complica la caratterizzazione del campo statunitense e di altre condizioni di esposizione ambientale, rendendo impegnativi i confronti tra studi. Ad esempio, vi è una notevole variazione nei parametri usa identificati per ottenere una sonoporazione riuscita, che includono frequenze al centro che vanno da 0,02 a 15 MHz, cicli di servizio che variano dall’1% all’onda continua e pressioni rarefazionali che vanno da 0,1 a 20 MPa23,64,67,68,69,70 (Tabella 1). Allo stesso modo vi è una notevole variazione nelle componenti spettrali (armoniche, sottooniche, ecc.) che sono state identificate come associate a particolari bioeffati.

Lo scopo di questo lavoro è quindi quello di fornire un quadro di progettazione e implementazione del sistema facilmente riproducibile per lo studio in vitro dei bioeffati cellulari indotti dalla cavitazione con l’inclusione specifica di una capacità di monitoraggio della cavitazione.

Protocol

1. Principi di progettazione del sistema NOTA: Questa sezione presenta i principi di progettazione utilizzati per creare sistemi per il monitoraggio dell’esposizione e della cavitazione negli Stati Uniti. Questi principi sono illustrati con due sistemi esistenti per la trasfezione acustica (SAT) (mostrati nella figura 1). Ogni sistema è costituito da un compartimento di esposizione cellulare, una sorgente statunitense e un trasduttore a singolo elemento che funziona come rilevatore di cavitazione passiva (PCD), tutti integrati in una camera di prova da banco. Questi progetti si basano sullo sviluppo del sistema precedente descritto inCarugo et al. Massimizza la facilità d’uso. Rendere il compartimento di esposizione cellulare compatibile con le tecniche di coltura e i sistemi di imaging esistenti utilizzando i dispositivi di coltura cellulare commerciale esistenti come substrati di semina/crescita. Per SAT2, utilizzare un piatto da coltura (diametro 35 mm, di cui un’area di diametro di 21 mm è osservabile, vedere Tabella dei materiali). Per SAT3, utilizzare un inserto Transwell (diametro 6,5 mm, vedere Tabella dei materiali). I Transwell hanno una membrana permeabile e quindi devono essere collocati nei supporti cellulari piuttosto che nell’acqua. Consentire il caricamento e la sigillatura rapidi del vano di esposizione cellulare. Formare il vano di esposizione cellulare SAT2 con pressa che monta un coperchio polimerico flessibile sopra il piatto di coltura (Carugo et al. 201565). Come si vede nella Figura 1C, il coperchio ha un paio di fori di 1,2 mm di diametro che consentono di riempire il vano con una siringa ad ago smussato da 18 G. Dopo il riempimento, sigillare queste porte di riempimento con aste di plastica corte(Tabella dei materiali). Riempire lo scomparto SAT3 con siringa o pipetta e sigillare con la pressa che monta un tappo/pasticcere in gomma. Consentire il caricamento rapido del compartimento di esposizione delle celle sigillate nella camera di prova. I supporti per i compartimenti di esposizione cellulare sono stati integrati nei coperchi della camera, dove una leggera pressa è sufficiente per garantire un corretto allineamento. Con i sistemi mostrati nella figura 1, il tempo per le modifiche del campione può essere breve fino a 20 secondi quando sono stati preparati in anticipo più compartimenti di esposizione alle celle. Ridurre al minimo il volume interno della camera in modo che il sistema sia portatile e la quantità di acqua/supporto richiesta possa essere ridotta al minimo. In questo modo si accelera anche il recupero da fuoriuscite accidentali o perdite di agenti di cavitazione fuori dal vano di esposizione cellulare.NOTA: Il volume interno sat2 è di circa 0,8 L. Il volume interno SAT3 è di circa 7,6 L, reso più grande per adattarsi al facile caricamento e cambio del trasduttore di origine o della sua configurazione. È stata aggiunta una camera interna di 0,3 L per ridurre al minimo il volume usa e getta e per consentire l’uso di fluidi biologicamente rilevanti diversi dall’acqua di riempimento del serbatoio (ad esempio, mezzi di coltura cellulare). Il fondo della camera interna è realizzato in lamiera milara spessa 30 μm per consentire la massima trasmissione acustica. Rendere la camera e i componenti interni da materiali otticamente chiari quando possibile, in modo che eventuali problemi (ad esempio, perdite, macrobolle intrappolate) possano essere rapidamente osservati e rimediati. Massimizzare la trasmissibilità acustica del vano di esposizione. Massimizza la trasmissibilità attraverso le scelte di materiali e spessori delle pareti del compartimento. Supponendo che i liquidi su entrambi i lati di una parete siano essenzialmente gli stessi (ad esempio, acqua), l’entità del coefficiente di trasmissione della pressione di incidenzanormale 71 è:, dove λ è la lunghezza d’onda nella parete di spessore L, , e z L e z osono le impedenze caratteristiche (prodotti di densità e velocità sonora) rispettivamente per il materiale della parete e il liquido. T = 1 indica una trasmissione perfetta. Per il monitoraggio ad ampio spettro della cavitazione (ad esempio, 1-8 MHz), la maggior parte dei polimeri di laboratorio (ad esempio PDMS, PTFE, polistirolo) altererà la pressione trasmessa di non più del 10% se lo spessore del materiale è inferiore a 1/10di lunghezza d’onda nel materiale. Questa condizione può essere difficile da soddisfare con le forniture standard ad alte frequenze (ad esempio, #1,5 coverslip a 8 MHz), quindi è buona norma prevedere o calibrare direttamente la risposta della frequenza di trasmissione. Per la trasmissione a banda stretta del segnale sorgente statunitense nel compartimento di esposizione cellulare, consentire uno strato più spesso se è approssimativamente un multiplo intero di mezza lunghezza d’onda nel materiale dello strato. Ad esempio, il coperchio PDMS in SAT2 viene utilizzato con uno spessore di 2,0 mm (~2 lunghezza d’onda a 1MHz, cPDMS ~ 1000 m/s). Massimizzare l’area di esposizione attraverso la selezione dell’ambiente sorgente e cellulare. Per massimizzare il numero di celle esposte, rendere l’area di attacco cellulare il più ampia possibile mantenendo la compatibilità con le apparecchiature di coltivazione e imaging disponibili. Utilizzare un’origine statunitense con un campo che si estende sull’area di attacco della cella con una variabilità spaziale minima utilizzando l’area pre-focale di una sorgente focalizzata di grandi dimensioni (SAT2) o una sorgente focalizzata o con obiettivo con una larghezza del lobo principale che corrisponde al diametro dell’area di attacco della cella (SAT3). Vedi la tabella dei materiali per fonti specifiche. Ridurre al minimo la complessità del campo introdotta dal supporto del vano cella supportando meccanicamente il vano cella ben lontano dalla parte più forte del campo incidente, riducendo al minimo la sezione trasversale di dispersione del supporto o posizionando il materiale assorbente sul supporto. Esempi sono riportati nelle figure 1A e 1D. Garantire condizioni di esposizione ripetibili. Terminare il campo acustico in un limite fisso per eliminare la variabilità che può derivare dalle interfacce aria-acqua in camere parzialmente riempite. In SAT2 e 3, questo viene ottenuto installando un assorbitore acustico (vedi Tavolo dei Materiali) sul coperchio della camera con un ulteriore vantaggio di ridurre la complessità del campo che può derivare da riflessioni al contorno. Monitorare e registrare la tensione dell’azionamento sorgente all’ingresso di uscita/sorgente dell’amplificatore in modo da poter rilevare rapidamente una variabilità minore o un malfunzionamento importante. Utilizzare una sonda di tensione o un altro dispositivo sicuro da utilizzare nell’intervallo di tensione di azionamento di interesse. Controllare periodicamente la calibrazione della sonda di tensione utilizzando una sorgente nota come un generatore di forme d’onda. Controllare, monitorare e registrare la temperatura della camera e il suo contenuto. Le risposte di cellule, trasduttori e mezzi di propagazione possono essere tutte sensibili alla temperatura. In SAT2, il monitoraggio e il controllo vengono realizzati con un paio di porte di circolazione collegate a un sistema di condizionamento dell’acqua, mentre SAT3 impiega un riscaldatore per acquari (non mostrato). Impostare la temperatura dell’acqua in base alle esigenze per imitare le condizioni fisiologiche rilevanti per l’applicazione terapeutica.NOTA: le temperature interne possono variare sia a causa di fattori esterni che a causa del riscaldamento generato dagli Stati Uniti del trasduttore e del mezzo. Degasare con cura i liquidi della camera per ridurre al minimo la probabilità di cavitazione e/o dispersione involontaria da bolle preesistenze nel percorso di propagazione.NOTA: se il degassamento non viene eseguito, ad esempio a causa dell’impatto negativo sulle cellule, ci sarà un livello di fondo migliorato di attività della bolla, per il quale adatto. Calibrare il sistema completamente assemblato. Includere un mezzo per misurare l’incidente del campo di pressione sulle celle esposte quando tutti i componenti del sistema sono in posizione, incluso il compartimento di esposizione cellulare. In SAT2 e 3, questo si ottiene con un’apertura nel coperchio della camera attraverso la quale un ago o un idrofono in fibra ottica potrebbe essere inserito senza disturbare il campo da misurare. Rendere le misurazioni il più vicino possibile al punto in cui si trovano le celle. Scegliere un idrofono con un raggio sensibile(un rcv) è abbastanza piccolo da non insegnare erroneamente il campo di pressione misurato. La dimensione accettabile è una funzione della frequenza disorgente( f ) e del raggio (unosrc) e della distanza tra la sorgente e la scansione del campo (zrcv). Un criterio generale per la selezione delle dimensioni dell’idrofono è: , che porta a: , dove c è la velocità delsuono 72. Assicurarsi che l’idrofono sia calibrato nelle condizioni utilizzate nella caratterizzazione del sistema, compresa la temperatura specificata nella sezione 1.6. In particolare, se l’idrofono è tenuto ad angolo rispetto al piano di scansione, l’idrofono deve essere calibrato a quell’angolo, poiché gli effetti di direttività possono differire significativamente da quelli attesi in base esclusivamente alla geometria. Il cambiamento della sensibilità all’idrofono rispetto alla temperatura dovrebbe essere disponibile presso il produttore. Eseguire la scansione dell’intera area in cui le celle possono essere esposte. Per catturare un livello appropriato di dettaglio del campo, utilizzare una spaziatura di scansione non più grossolana di 1/5di lunghezza d’onda alla massima frequenza di interesse. Se si osserva una complessità di campo inaspettata, prendere in considerazione l’utilizzo di brevi segnali burst (ad esempio, 1-3 cicli) per consentire l’identificazione e la quantificazione dei contributi diretti e sparsi sul campo. Incorporare una capacità di monitoraggio della cavitazione. Determinare il tipo di trasduttore di monitoraggio e il posizionamento come parte della progettazione del sistema complessivo, piuttosto che come retrofit. In pratica, questo porta a un sistema che è estremamente compatto senza sacrificare la possibilità di allineare in modo affidabile i componenti critici del sistema. Posizionare un dispositivo di monitoraggio della cavitazione nel sistema in modo tale che possa essere posizionato in modo ripetuto con un tempo di configurazione o un disturbo minimo aggiunto al flusso di lavoro. In SAT2, questo viene realizzato con un trasduttore piezoelettrico a singolo elemento che funge da PCD montato nel coperchio della camera, mentre SAT3 integra il PCD nella base di origine utilizzando un riflettore a 90°. Selezionare la forma PCD in base agli obiettivi degli esperimenti. Nella figura 2, i calcoli dei contorni di semi-ampiezza dei dispositivi non focalizzati (a sinistra) e focalizzati (a destra) mostrano le profonde differenze nella sensibilità spaziale rispetto alla frequenza. Il dispositivo non focalizzato è più adatto per il monitoraggio di grandi volumi con modeste variazioni spaziali rispetto alla frequenza, mentre il dispositivo focalizzato è più adatto per misurazioni più compatte radialmente alle frequenze di interesse. Selezionare la frequenza centrale PCD e la larghezza di banda in base alle esigenze dell’esperimento. La frequenza centrale è tipicamente scelta per essere almeno cinque volte quella della sorgente statunitense al fine di ridurre al minimo la sensibilità alle emissioni dirette della sorgente. La larghezza di banda è in genere massimizzata per osservare un’ampia gamma di comportamenti delle bolle (rumore armonico e a banda larga). Selezionare i metodi di condizionamento, registrazione ed elaborazione per consentire l’analisi dei dati di cavitazione, come descritto nella sezione successiva. 2. Strumentazione ed elaborazione per il monitoraggio della cavitazione NOTA: Questa sezione presenta i componenti e le funzioni del flusso del segnale raccomandati per la raccolta dei dati di monitoraggio della cavitazione e l’elaborazione dei dati che porta a valutazioni qualitative e quantitative dell’attività di cavitazione. Strumentazione (vedere anche figura 3). A meno che l’applicazione non richieda un dispositivo personalizzato, selezionare un PCD dall’ampia gamma di trasduttori a singolo elemento disponibili in commercio, in genere commercializzati per test non distruttivi di destinazioni sommerse. Questi fornitori hanno anche cavi e accessori (ad esempio, il riflettore a specchio in SAT3). Ridurre al minimo la risposta PCD all’origine statunitense. Questo può essere fatto sia attraverso la selezione del PCD (frequenza centrale e larghezza di banda) sia utilizzando una tacca o un filtro passa alto. Quest’ultimo è implementabile sia come modulo autonomo che come parte di un dispositivo di condizionamento del segnale. Utilizzare un digitalizzatore con un ampio intervallo dinamico (almeno 12 bit) per acquisire quanti più dati possibili con la minima probabilità di un elevato ritaglio del segnale e di un rapporto segnale/rumore (SNR) massimo dei segnali più piccoli. Quando si confrontano i dispositivi, rivedere le specifiche per il segnale al rumore e alla distorsione e/o al numero effettivo di bit, in quanto si tratta di descrizioni più complete dell’intervallo dinamico raggiungibile. Considerare anche se la dimensione del buffer di memoria è sufficiente per la lunghezza e la frequenza desiderate di acquisizione dei dati. Ottimizzare l’utilizzo dell’intervallo dinamico del digitalizzatore. I segnali PCD possono coprire diversi ordini di grandezza, sia a causa di una lunga esposizione (poiché le bolle vengono eliminate) sia se eseguono esperimenti a vari livelli di azionamento degli Stati Uniti. È quindi necessario verificare che la catena di condizionamento del segnale bilance tutti i segnali in modo che possano essere correttamente registrati. Includere un preamplificatore nella catena del segnale, in modo che i segnali previsti più piccoli possano essere adeguatamente acquisiti. Nella nostra esperienza, l’autorrosione PCD è ben al di sotto di quello della maggior parte dei digitalizzatori, quindi un modesto grado di preamplificazione (ad esempio, <100x) può ancora migliorare l'SNR del risultato finale. Filtrare la frequenza della sorgente statunitense prima della preamplificazione per evitare di saturare l’amplificatore. Se un pulser/ricevitore statunitense viene utilizzato per fornire funzionalità di guadagno e/o filtraggio, utilizzarlo in modalità pulser per confermare la lunghezza/allineamento del percorso o verificare la presenza di scatterer imprevisti nel percorso di propagazione tra il PCD e il compartimento di esposizione delle celle. Abilita lo streaming in tempo reale dei dati nell’archiviazione. I sistemi SAT2 e SAT3 utilizzano entrambi oscilloscopi USB in streaming a 12 bit (vedi Table of Materials), che hanno le comodità della portabilità e interfacce utente ben costruite. Confermare la corretta corrispondenza dell’impedenza nella catena del segnale per evitare errori di guadagno o larghezza di banda. I dispositivi PCD hanno in genere impedenze di uscita vicino a 50 ohm, quindi un processo adatto è quello di sostituire il PCD con un segnale noto da un generatore di forme d’onda (con impedenza di uscita di 50 ohm) e confermare che la dimensione del segnale che appare sul digitalizzatore corrisponde alle aspettative, si ridimensiona linearmente quando il segnale iniettato viene modificato e non viene osservato alcun clipping per il più grande segnale di interesse. Pre-elaborazione Correggere i segnali di tensione grezza per tutti i guadagni e le sensibilità noti nel percorso del segnale che si riferiscono all’elaborazione dei dati nell’intervallo di frequenza di interesse. Se i dati sono stati registrati con l’accoppiamento di input CC o mostrano in altro modo un offset CC, rimuovere questo offset per sottrazione diretta o con un filtro passa alto. Calcola lo spettro di potenza P di ogni segnale registrato. Impostare la lunghezza della trasformazione di Fourier Nft in modo che la frequenza fondamentale della sorgente statunitense f0 sia un grande multiplo intero della larghezza del contenitore di trasformazione: Nft =   nfs/f0, dove n è un intero e f s è la frequenza del campione dei dati digitalizzati. Impostare n ≥ 50 per una chiara acquisizione delle feature spettrali. Per l’esempio di un fondamentale a 1 MHz campionato a 50 MHz, Nft è 2500 e la larghezza del contenitore è di 0,02 MHz. Poiché la lunghezza di trasformazione Nft è solitamente inferiore alla durata del segnale registrato, utilizzare uno stimatore di densità spettrale dipotenza (PSD)come il metodo73 diWelch. La potenza in una banda di frequenza che si estende su f1-f2 è , dove dF è la larghezza del contenitore di trasformazione. Per caratterizzare l’attività della bolla durante ogni esposizione, stimare i contributi allo spettro di potenza da multipli interi di f0 (armoniche), multipli interi dispari di f0/2 (ultraarmonici) e rumore a banda larga (cavitazione inerziale). Il contenuto armonico e ultraarmonico è stimato più semplicemente selezionando i valori dello spettro di potenza a frequenze specifiche. Tuttavia, le risposte tonali di ampiezza di grandi dimensioni possono diffondersi in un piccolo numero di contenitori di frequenza adiacenti (ad esempio f0 ± 2-3), quindi questi dovrebbero essere inclusi nei calcoli di potenza a banda stretta ed esclusi dai calcoli della banda larga. Stimare la potenza di cavitazione della banda larga sottraendo i contributi armonici e ultraarmonici dallo spettro di potenza totale. In alternativa, questi contributi possono essere stimati utilizzando una pre-elaborazione più sofisticata74. Stimare l’energia cumulativa del segnale di cavitazione per tutta la durata dell’esposizione, preferibilmente in base alla caratteristica dello spettro / tipo di attività della bolla. Supponendo che tutti i record di dati avessero la stessa durata Tr, l’energia cumulativa nei dati registrati è , dove M indica il numero di record. Se ci sono lacune tra le registrazioni, come può accadere quando l’esposizione è continua, e i file salvati catturano una frazione della durata totale dell’esposizione T e , l’energiacumulativa può essere stimata come Stimare la misura SNR rispetto ai livelli di spettro con quelli del rumore di fondo registrati in assenza di US. 3. Protocollo sperimentale Preparazione SAT Ridurre al minimo la probabilità di cavitazione nel percorso di propagazione degassando il liquido di riempimento (tipicamente acqua filtrata) sotto una pressione di -105 Pa per almeno due ore. Si raccomanda la conferma con una sonda di ossigeno disciolta che la pressione parziale dell’ossigeno è inferiore a 10 kPa. Riempire lentamente la camera di prova per ridurre al minimo la re-introduzione dell’aria nel liquido degassato. Continuare a degassare la camera riempita, se necessario. Cancellare tutte le bolle residue dalle superfici del trasduttore e del contenitore multimediale immediatamente dopo il riempimento e di nuovo poco prima di iniziare gli esperimenti di esposizione. Assicurarsi che la temperatura della camera e il suo contenuto si siano stabilizzati prima di iniziare gli esperimenti di esposizione. Consentire all’amplificatore di potenza sorgente statunitense di riscaldarsi (per raccomandazione del produttore) in modo che il guadagno e l’uscita siano stabili rispetto al tempo. Preparazione del compartimento di esposizione Sospensione dell’agente di cavitazione Quando si dilui l’agente di cavitazione, mescolare delicatamente e continuamente per effettuare una sospensione uniforme senza intrappolare macrobolle o distruggere l’agente (specialmente se sono bolle sgusciate). Quando si lavora con gli MB, prelevare e erogare lentamente utilizzando l’ago di misura più grande disponibile per ridurre al minimo la distruzione durante il processo dicaricamento 75. Un ago di riempimento smussato da 18 G è stato utilizzato regolarmente con i sistemi SAT. Preparazione SAT2 Sterilizzare il coperchio PDMS prima dell’uso in esperimenti con cellule vive. Formare il vano di esposizione cellulare con la pressa che adatta il coperchio PDMS al piatto di coltura. Preparare una siringa con un ago smussato da 18 G e riempire con circa 10 ml di liquido (ad esempio, sospensione MB o controllo dell’acqua). Inserire l’ago attraverso uno dei fori di riempimento PDMS e riempire lentamente la camera, inclinando in modo che le macrobolle possano fuoriuscire attraverso il foro di riempimento aperto. Per ottenere risultati ottimali, inclinare la camera in modo che il foro aperto si trova sopra il foro di riempimento. Una volta riempito, chiudere il foro aperto inserendo una breve asta polimerica (4-5 mm). Impostate l’assieme in modo che entrambi i fori siano orizzontali. Rimuovere l’ago di riempimento smussato durante l’iniezione di liquido extra in modo che l’aria non sia attirata. Chiudere il foro con un’altra asta di polimero. Questo processo completa la sigillatura del vano di esposizione cellulare. Controllare visivamente nel compartimento la presenza di macrobolle intrappolate e, se presenti, ripetere 3.3.3.-3.3.6. Premere il vano di esposizione cellulare nel supporto del vano. Installare il coperchio della camera in posizione in cima alla camera. Abbassare il coperchio con un angolo orizzontale scoraggia le macrobolle dal riposare sulle parti sommerse (assorbitore, supporto). Si consideri la galleggiabilità delle particelle in sospensione quando si decide l’orientamento del compartimento di esposizione cellulare (ad esempio, bolle galleggianti o nanoparticelle che affondano) e come questo influenzerà il loro contatto con le cellule. In tutte le operazioni, utilizzare la meno forza possibile per ridurre al minimo la flessione della superficie di crescita cellulare e il distacco delle cellule. Preparazione SAT3 Riempire il Transwell con circa 150 μL di liquido (ad esempio, sospensione MB o controllo dell’acqua). Formare il vano di esposizione cellulare sigillando accuratamente il trasliccio con un tappo di gomma, rimuovendo qualsiasi liquido di overflow con un tovagliolo di carta pulito o una salvietta. Prima dell’uso in esperimenti con cellule vive, sterilizzare il tappo di gomma. Controllare visivamente nel compartimento la presenza di macrobolle intrappolate e, se presenti, rimuovere la spina, rimuovere le macrobolle e ripetere 4.4.2. Premere il vano di esposizione cellulare nel supporto del vano. Installare il coperchio della camera in posizione in cima alla camera. Abbassare il coperchio con un angolo orizzontale scoraggia le macrobolle dal riposare sulle parti sommerse (assorbitore, supporto).NOTA: Come notato sopra, le macrobolle possono causare una varietà di effetti non ripetibili e potenzialmente dannosi sugli esperimenti di esposizione negli Stati Uniti. La cosa più critica è che le macrobolle intrappolate nel compartimento di esposizione cellulare possono causare risposte pcd e bioeffati cellulari locali che non sono rappresentativi del trattamento previsto. Ispezionare sempre visivamente tutti i componenti di sistema per trovare e rimuovere macrobolle prima di avviare esperimenti negli Stati Uniti. 4. Raccolta dei dati Stabilire livelli di risposta PCD di base conducendo esperimenti iniziali con un compartimento di esposizione cellulare pieno di liquido di controllo (ad esempio, acqua degassata o supporti cellulari). Registra i dati PCD senza guidare la fonte statunitense a stabilire livelli di rumore elettronico di fondo. Registra i dati PCD mentre guidi l’origine statunitense all’intera gamma di livelli di azionamento pianificati. Questi dati indicheranno quali parti della risposta acustica non sono correlate agli agenti di cavitazione da testare successivamente.NOTA: I liquidi di laboratorio comuni (ad esempio PBS o supporti cellulari) mostreranno cavitazione a pressioni moderate (ad esempio 0,5 MPa a 0,5 MHz) se non degassati. Prima di iniziare le misurazioni, dare il tempo alla sospensione di equilibrare termicamente con la temperatura della camera. Una termocopia ad ago fine può essere utile a questo scopo. Monitora gli esperimenti in tempo reale sia nei domini del tempo che in quello delle frequenze. Il monitoraggio del dominio del tempo del PCD rivela se i segnali sono dimensionati in modo appropriato per le impostazioni correnti della strumentazione. In particolare, il ritaglio del segnale deve essere evitato, poiché apparirà nel dominio della frequenza come risposta armonica multi-tono. Il monitoraggio del dominio del tempo del PCD mostra anche se i segnali di cavitazione sono visti prima del previsto in base al tempo di propagazione dalla sorgente statunitense al compartimento di esposizione al PCD. Se si vedono tali segnali, ciò può indicare una perdita di agente di cavitazione nella camera di prova. Il monitoraggio del dominio di frequenza del PCD indica il tipo di comportamento della bolla e può essere utilizzato per regolare i livelli di unità in base alle esigenze per ottenere lo stimolo cellulare desiderato (ad esempio, livelli di azionamento più bassi per l’eccitazione armonica). Per assicurarsi che le prime esposizioni non vengano perse, avviare il processo di raccolta dei dati prima di accendere il segnale dell’unità sorgente degli Stati Uniti. Monitora il segnale di uscita dell’amplificatore che guida la sorgente statunitense (al contrario dell’uscita del generatore di forme d’onda) durante l’esperimento per garantire che l’esposizione proceda come previsto. Utilizzare una sonda ad alta tensione per questa misurazione e assicurarsi che l’oscilloscopio sia impostato per compensare l’attenuazione della sonda. Dopo aver esposto un campione, rimuoverlo con cura dalla camera di prova. Rimuovere e pulire il coperchio PDMS (SAT2)/spina di gomma (SAT3) in preparazione per qualsiasi uso successivo. Trasferire il piatto di coltura (SAT2)/Transwell (SAT3) secondo necessità per analisi successive (ad esempio, microscopia, imaging a fluorescenza). Dopo un piccolo numero di esposizioni (ad esempio, 3-5), è buona prassi ria acquisire segnali di cavitazione di base (in assenza di agente cavitazione) e confrontarli con il set di dati originale per assicurarsi che i supporti della camera non siano stati contaminati.

Representative Results

La figura 4 mostra esempi di risposte PCD del dominio del tempo e della frequenza, illustrando tre distinti comportamenti di cavitazione. Tutti i dati sono stati raccolti su SAT3 utilizzando MB SonoVue diluiti 5x in PBS, con una concentrazione finale di ~ 2 * 107 MB / ml. La temperatura per tutti gli esempi in questa sezione era di 19 ± 1 °C. La sorgente statunitense è stata guidata con un impulso di 2,0 ms a 0,5 MHz per ottenere pressioni negative di picco incidente di 0,20(Figure 4A e 4B),0,30(Figura 4C e 4D)e 0,70 MPa(figure 4E e 4F). Le registrazioni del segnale iniziarono 1,4 ms prima dell’inizio t = 0 dell’impulso statunitense. Le tracce di ingresso mostrano il segnale registrato (rosso) e con un filtro passa alto a 2 MHz (blu) per una finestra di tempo centrata al momento del volo dalla sorgente al compartimento di esposizione cellulare al PCD. La risposta di basso livello prima di questo tempo è dovuta alla radiazione ricevuta direttamente dalla sorgente, che è comune nelle configurazioni in cui il PCD è dietro la sorgente statunitense. Alla pressione incidente più bassa, la risposta PCD consiste interamente di armoniche intere della frequenza fondamentale degli Stati Uniti di 0,5 MHz. Aumentando da 0,20 a 0,30 MPa si ottiene un’ultraarmonica pronunciata nello spettro oltre ad armoniche intere ulteriormente elevate. Le forme d’onda del dominio del tempo a queste due pressioni sembrano simili, anche se i risultati di 0,30 MPa mostrano una maggiore variabilità durante la durata dell’impulso. Alla pressione più alta, l’ampiezza della forma d’onda del dominio del tempo è cresciuta in modo non lineare rispetto alle pressioni più basse a causa del rumore a banda larga chiaramente elevato visibile nello spettro. Questo rumore è comunemente considerato come il risultato della cavitazione inerziale e in questo esempio corrisponde alla distruzione di MB. Per vedere questo più chiaramente, le risposte PCD in funzione del tempo sono mostrate nella figura 5. Nel pannello sinistro (Figura 5A), gli spettri completi vengono visualizzati su un tempo di esposizione di 50 secondi, durante il quale la sorgente emette impulsi da 2,0 ms ogni 0,20 secondi. Le corrispondenti potenze totali, armoniche e a banda larga sono mostrate nel pannello di destra (Figura 5B). Gli Stati Uniti sono stati attivati a t =3,0 s, quando sono state viste risposte a banda larga di grande ampiezza. Si pensa che il picco iniziale corrisponda alla distruzione delle bolle più grandi della sospensione (SonoVue è polidisperso) ed è un’osservazione comune negli esperimenti di cavitazione con bolle sgusciate e persino con mezzi non degassati (ad esempio, PBS). Dopo pochi secondi, la risposta a banda larga si sminuì rapidamente, apparentemente a causa della distruzione della bolla, e il segnale è composto prevalentemente da armoniche. Ciò suggerisce che il gas liberato e le MB rimanenti vibrano stabilmente e non inerzialmente. A t~50, il componente a banda larga è sceso al livello del rumore di fondo originale. Test di esposizione come questo sono quindi importanti quando si cerca di capire i tempi durante i quali diversi effetti bolla possono agire sulle cellule della camera. È probabile che le bolle si traducano in risposta alle forze di radiazione generate durante l’esposizione statunitense e il movimento degli MB all’interno e all’esterno del campo visivo pcd può portare a una maggiore variabilità nel segnale di cavitazione monitorato, specialmente quando si tratta di sospensioni diluite. La regione sensibile della PCD dovrebbe quindi estendersi il più possibile sulla superficie di esposizione cellulare. Un confronto delle risposte focalizzate e non focalizzate pcd con frequenze centrato identiche (vedere la figura 2) è mostrato nella figura 6, utilizzando una diluizione 20:1 di MB nel NORMALE PBS è SAT2. Gli spettri medi del tempo e del campione nel pannello Figura 6A mostrano che il PCD non focalizzato contiene una risposta a banda larga più forte, accompagnata da una ridotta variabilità da campione a campione sia in potenze armoniche(figura 6B) che ultraarmoniche (Figura 6C). È importante riconoscere che i supporti utilizzati per il lavoro cellulare in vitro non sono degassati e possono presentare un livello di fondo migliorato di attività della bolla. La figura 7 mostra la risposta in SAT2 di PBS utilizzato nella sua forma fornita dal fornitore e dopo due ore di degassamento sotto vuoto, dopo di che la saturazione dell’aria è stata ridotta dal 92% al 46% come determinato con un sensore ottico (PreSens, Germania). Gli spettri della figura 7A sono stati mediati nel tempo di esposizione e ripetuti con cinque campioni indipendenti, e mostrano chiaramente ultraarmonici chiaramente elevati nel normale PBS. Le potenze sommate su tre armoniche(Figura 7B)sono ben all’interno della deviazione standard di ogni uscita sperimentale. Al contrario, le somme ultraarmoniche della figura 7C mostrano che il PBS normale ha quasi un ordine di grandezza di livello superiore e una variabilità sostanzialmente più elevata tra i campioni. Questi esempi indicano che un comune supporto compatibile con le celle può presentare comportamenti che potrebbero essere (erroneamente) attribuiti alla presenza di MB. Poiché di solito è poco pratico degasare il mezzo di coltura a causa dell’impatto negativo sulle cellule e / o sulla stabilità dell’agente di cavitazione, è fondamentale eseguire controlli adatti in qualsiasi studio correlato alla cavitazione. Figura 1: Illustrazioni di due progetti di sistemi di esposizione statunitense che incorporano il monitoraggio della cavitazione: SAT3 (D-F). (A) Gruppo annotato SAT2 con parete laterale rimossa per chiarezza. (B) SAT2 con parete laterale intatta. (C) Compartimento di esposizione cellulare SAT2, smontato. (D) Assemblaggio annotato SAT3. (E) SAT3 in configurazioni normali (sinistra) e con lenti (destra) per la corrispondenza della larghezza del fascio a frequenze diverse. (F) Compartimento di esposizione alle celle SAT3, smontato. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 2: Calcoli dei contorni del campo di pressione a mezza ampiezza per trasduttori non focalizzati (a sinistra) e sfericamente focalizzati (a destra). Le frequenze di 2, 4 e 8 MHz sono mostrate rispettivamente come contorni rossi, blu e verdi per un elemento PCD all’origine delle coordinate (0,0). I contorni più esterni del dispositivo non focalizzato sono relativamente insensibili alla frequenza, ma la struttura interna dipende dalla frequenza. Il campo sfericamente focalizzato si contrae all’aumentare della frequenza, ma all’interno dei contorni, i campi variano senza intoppi. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 3: Strumentazione per il condizionamento e la registrazione del segnale di cavitazione (frecce blu), eccitazione della sorgente statunitense (linee rosse) e attivazione dell’acquisizione dei dati. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 4: Risposte PCD di dominio di dominio tempo (sinistra) e frequenza (destra) registrate con MB diluiti 5x in PBS. Le pressioni negative di picco incidente sono state (A, B) 0,2 MPa, (C, D) 0,4 MPa, (E, F) 0,7 MPa, il tutto a 0,5 MHz. Le registrazioni del segnale iniziano 1,4 ms prima dell’inizio t =0 dell’impulso ecografico di durata 2,0 ms. (A, C, E) I segnali del dominio del tempo (rosso) sono mostrati su una scala verticale fissa, indicando come cambia il livello di risposta con la pressione incidente. Le tracce di ingresso mostrano il segnale registrato (rosso) e con un filtro passa alto a 2 MHz (blu) per una finestra di tempo centrata al momento del volo dalla sorgente al compartimento di esposizione cellulare al PCD. (B, D, F) Le densità spettrali di rumore e potenza del segnale sono calcolate rispettivamente per t0. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 5: Cronologie dello spettro su un’esposizione di 50 secondi di una sospensione di MB diluita 5 volte in PBS. (A) Spettri completi e (B) potenze totali, armoniche e a banda larga, il tutto in funzione del tempo. Le condizioni di azionamento erano 0,5 MHz, pressione negativa di picco di 0,7 MPa, durata dell’impulso di 2,0 ms, periodo di ripetizione dell’impulso di 200 ms. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 6: Effetto della geometria di messa a fuoco PCD registrata con una diluizione 20:1 di microbolle nel normale PBS. Le condizioni di azionamento erano: 1,0 MHz, 0,50 MPa di pressione negativa di picco, durata dell’impulso di 3,0 ms, periodo di ripetizione dell’impulso di 10 ms. (A) Spettri completi medi sul tempo di esposizione e tre ripetizioni indipendenti del campione. (B) Potenza nelle armoniche a 3, 4 e 5 MHz e (C) di potenza in ultraarmonica a 2,5, 3,5 e 4,5 MHz. Le linee spesse sono mezzi campione, le aree ombreggiate indicano +/- 1 deviazione standard. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 7: Effetto dei supporti degassati registrati con PBS. (A) Spettri completi medi sul tempo di esposizione e cinque ripetizioni indipendenti del campione. (B) Potenza nelle armoniche a 3, 4 e 5 MHz e (C) di potenza in ultraarmonica a 2,5, 3,5 e 4,5 MHz. Le linee spesse sono mezzi campione, le aree ombreggiate indicano +/- 1 deviazione standard. Le condizioni di azionamento erano 1,0 MHz, 0,50 MPa di pressione negativa di picco, durata dell’impulso di 1,0 ms, periodo di ripetizione dell’impulso di 200 ms. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. parametro unità minimo massimo frequenza megahertz 0.02 15 pressione (picco negativo) Mpa 0.1 20 lunghezza dell’impulso Cicli 1 Cw Ciclo % 1 Cw tempo di esposizione di 10 1000 Tabella 1: Sintesi della gamma di parametri segnalati che facilitano la sonoporazione in vitro.

Discussion

I passaggi critici per qualsiasi misurazione acustica sono stati incapsulati da Apfel nel 198176 come “conosci il tuo liquido, conosci il tuo campo sonoro, sa quando succede qualcosa”. Nel contesto di questo protocollo, questi comprendono la calibrazione e l’allineamento del trasduttore e le fasi di preparazione dell’acqua e di movimentazione delle bolle. In primo luogo, è essenziale che l’idrofono utilizzato per calibrare il trasduttore di guida e/o il PCD sia a sua volta calibrato con precisione attraverso una regolare manutenzione esterna o un confronto interno con uno standard di riferimento. Allo stesso modo, la risposta sia del trasduttore di guida che della PCD deve essere regolarmente caratterizzata per verificare eventuali cambiamenti nell’uscita e/ o perdita di sensibilità. Se le condizioni di guida e la sensibilità del sistema sono sconosciute, sarà impossibile dedurre alcuna relazione significativa tra condizioni di esposizione, bioeffetto ed emissioni acustiche. Direttamente correlato a questo, l’allineamento dei trasduttori tra loro e la camera campione devono essere attentamente controllati per garantire che le condizioni di esposizione all’interno della camera siano come previsto e che il volume di campionamento per la PCD corrisponda alla regione di interesse. Come indicato, la temperatura e il contenuto di gas del mezzo di sospensione possono influire in modo significativo sui risultati finali e la coerenza è estremamente importante aquesto proposito 77,78. Allo stesso modo, la preparazione, la caratterizzazione e la manipolazione della sospensione dell’agente di cavitazione richiedono molta attenzione per garantire che la distribuzione delle dimensioni e la concentrazione previste di particelle siano presenti all’interno del campione. Ad esempio, se la concentrazione di bolle è troppo alta, ci sarà una schermatura efficace del volume del campione dal campo statunitense incidente. Gli agenti MB sono particolarmente suscettibili alla distruzione e alla coalescenza e ulteriori indicazioni sulla loro manipolazione possono essere trovate a Mulvana et. (2012)79.

Un problema molto comune con il rilevamento dei segnali di cavitazione è il raggiungimento di un SNR adeguato. Ciò è dovuto in parte alla natura del segnale stesso, come descritto, ma può anche essere dovuto a fonti di rumore elettrico all’interno dell’impianto sperimentale. Il controllo delle connessioni tra i componenti del sistema, in particolare quelli che coinvolgono cavi coassiali, può contribuire ad eliminarli. Potrebbe essere necessaria la sostituzione o la riparazione di cavi coassiali. Anche identificare e rimuovere o disattivare altre apparecchiature in laboratorio, come le pompe che possono causare rumore elettrico, possono essere d’aiuto. Una scarsa corrispondenza dell’impedenza elettrica tra i componenti del sistema può essere un’ulteriore causa di scarso rapporto segnale/rumore e anche potenzialmente di danni alle apparecchiature e deve essere attentamente controllata. Le impostazioni di attivazione sul generatore di segnale e sull’oscilloscopio devono essere controllate in modo simile per confermare che sono configurate in modo appropriato per l’esperimento e non sono tornate alle impostazioni predefinite del produttore. Se c’è una distruzione significativa di bolle durante la manipolazione, nel caso del SAT2, può essere utile attaccare una seconda siringa alla porta di uscita e usarla per estrarre delicatamente il fluido dalla camera, disegnando così la sospensione. Questo può anche aiutare a eliminare le macrobolle o abilitare il flusso durante l’esposizione negli Stati Uniti, se lo si desidera.

Non è possibile eliminare completamente i riflessi acustici all’interno della camera campione e quindi il campo incidente non sarà completamente uniforme sull’intero volume del campione. Come indicato nei passaggi 1.3.2 e 1.3.3, la trasmissibilità delle finestre acustiche dipenderà dalla frequenza e quindi la larghezza di banda desiderata per le misurazioni delle emissioni acustiche dovrebbe essere attentamente considerata. In particolare, possono esserci riflessi multipli significativi di componenti a frequenza più elevata. Questo è un altro motivo per cui la calibrazione del campo all’interno del sistema completamente assemblato è così importante per ridurre al minimo l’incertezza nella pressione incidente. Si dovrebbe inoltre prendere in considerazione un’adeguata riduzione al minimo degli effetti di più riflessioni. L’uso di dispositivi commerciali per comodità e la necessità di trasparenza acustica significano che occorre sacrificare una certa trasparenza ottica. Ciò può influire sulla qualità dell’imaging successivo, ad esempio per valutare la vitalità cellulare o l’assorbimento di farmaci. Alcune delle membrane utilizzate nei dispositivi commerciali sono anche porose e, quindi, si verifica un isolamento imperfetto tra la camera campione e il bagno d’acqua circostante. Come sopra, il corrispondente rischio di contaminazione può essere mitigato utilizzando una sottocamera più piccola, il cui contenuto può essere regolarmente sostituito. I dispositivi di coltura cellulare indicati nella tabella dei materiali sono adatti principalmente per monostrati cellulari che potrebbero non essere rappresentativi dei tessuti in termini di tutti i bioeffati mediati dalla cavitazione/cavitazione. La vicinanza delle cellule a una superficie solida influenzerà anche la dinamica MB in un modo che potrebbe non riflettere le condizioni in vivo, ad esempio promuovendo il microstreaming e il microjetting come descritto nell’introduzione. Queste limitazioni possono essere affrontate, tuttavia, attraverso una semplice sostituzione di modelli tissutali alternativi.

L’obiettivo della proposta delle AST è quello di fornire uno strumento per migliorare la riproducibilità delle condizioni di esposizione acustica e delle emissioni acustiche tra gli studi sui bioeffati mediati negli Stati Uniti, facilitando così, si spera, una migliore comprensione dei meccanismi sottostanti e lo sviluppo di tecniche di monitoraggio del trattamento per migliorare la sicurezza e l’efficacia. I sistemi sono progettati per essere compatibili con i dispositivi di coltura cellulare disponibili in commercio, consentendo di eseguire un’ampia gamma di saggi biologici in base all’applicazione di interesse e consentendo le prestazioni di esperimenti ad alta produttività, eliminando la necessità di procedure di allineamento dispendiose in termini di tempo tra le corse. Standardizzando i protocolli per la caratterizzazione delle condizioni di esposizione e la cattura delle emissioni acustiche, si spera che la variabilità dipendente dal sistema possa essere ridotta. La gamma di parametri che dovrebbero essere esplorati per un particolare esperimento dipenderà dall’applicazione (bio-effetto desiderato, tipo di cellula, profondità del tessuto bersaglio se in vivo, ecc.) e dalla natura di qualsiasi agente di cavitazione utilizzato. Dato il gran numero di variabili (frequenza usa, ampiezza della pressione, lunghezza dell’impulso, frequenza di ripetizione dell’impulso, ecc.) è improbabile che esplorare completamente l’intero spazio dei parametri sia praticabile. Un vantaggio del protocollo proposto è che consente di stabilire rapidamente alcuni limiti su questo spazio dei parametri. Ad esempio, consente di determinare la pressione minima alla quale viene generato un segnale di cavitazione, la pressione massima o la lunghezza dell’impulso che può essere utilizzata prima che si verifichi il distacco/morte cellulare e la pressione alla quale vengono prodotte armoniche frazionarie o rumore a banda larga. Si raccomanda di effettuare una tale serie di misurazioni dell’ambito come primo passo in qualsiasi studio.

Come presentati, i TEST sono progettati per il monitoraggio in tempo reale delle emissioni acustiche, con test biologici eseguiti al di fuori dell’esperimento. Sarebbe relativamente semplice, tuttavia, modificare il SAT per consentire l’osservazione ottica diretta della camera campione attraverso un obiettivo al microscopio. Ciò potrebbe a sua volta essere abbinato a un sistema di fluorescenza e/o microscopia ad alta velocità per consentire, ad esempio, l’osservazione dell’assorbimento dei farmaci e della dinamica delle bolle. L’uscita PCD attualmente presentata in termini di tensione indica: i) i tipi di comportamento di cavitazione e le loro proporzioni relative; ii) per quanto tempo persistono questi comportamenti di cavitazione; iii) se le caratteristiche osservate di esposizione cumulativa nel tempo sono correlate a un particolare bioeffetto; e iv) se i livelli relativi e i comportamenti dipendenti dal tempo sono coerenti con gli esperimenti precedenti nel sistema di esposizione. Mentre la sensibilità di ricezione del PCD può essere quantificata, al fine di caratterizzare in modo affidabile le emissioni acustiche in termini di energia assoluta, sono necessarie ulteriori informazioni spaziali. Questo potrebbe essere ottenuto sostituendo il PCD con una sonda array per implementare la mappatura acustica passiva (PAM)80. Ciò aumenterebbe comunque la complessità dell’elaborazione del segnale e il tempo e la potenza computazionali richiesti.

Potrebbero essere incorporate anche altre strumentazioni per la misurazione della resistenza elettrica a membrana o l’applicazione di metodi di targeting fisico, ad esempio campi magnetici. Sarebbe anche possibile utilizzare strutture tissutali tridimensionali come sferoidi tumorali, organoidi o persino campioni di tessuto ex vivo su substrati di gel acusticamente “morbidi” al posto dei monostrati cellulari per studiare gli effetti mediati da US e cavitazione in ambienti tissutali più realistici.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Gli autori ringraziano il Consiglio di Ricerca di Ingegneria e Scienze Fisiche per aver sostenuto questo lavoro attraverso la sovvenzione EP/L024012/1. VB è inoltre supportato dal Consiglio di ricerca in ingegneria e scienze fisiche (EPSRC) e dal Medical Research Council (MRC) (sovvenzione EP/L016052/1). VB e AV ringraziano la Clarendon Foundation for Post Graduate Scholarships. AV ringrazia anche l’Exeter College per una borsa di studio Santander. Gli autori sono in debito con James Fisk e David Salisbury per la loro preziosa assistenza nella produzione dell’apparato. Riconoscono anche con gratitudine i contributi dei dottori Dario Carugo e Joshua Owen nello sviluppo di precedenti TEST prototipo.

Materials

Absorber Precision Acoustics APTFlex F28 panel 1.0 cm standard thickness
Amplifier (power) E&I Ltd. 1040L 400W power amplifier to drive ultrasound source
Amplifier (pre) Stanford Research Systems SR445A Fixed gain multi-stage preamplifier for PCD signals
Aquarium heater Aquael Ultra 50W Different models for different tank sizes.
Digitizer TiePie Engineering HS5-110-XM Extended memory option: 32M points per channel
Hydrophone Precision Acoustics FOH 0.01 mm diameter sensitive area minimises directivity effects
Microbubbles Bracco SonoVue FDA approved microbubbles
PCD mirror (SAT3) Olympus NDT F-102 90 degree beam reflection
PCD transducer Olympus NDT V320-SU Immersion transducer, 7.5MHz
PCD waterproof cable Olympus NDT BCU-58-1 W
PDMS (SAT2 compartment lid) Corning Sylgard 184 See Carugo et al. (2015) for preparation guidelines
Polymer rod (SAT2 seal) Zeus PTFE monofilament
Rubber plug (SAT3 lid/seal) VWR 391-2101 6mm bottom dia., 8mm top dia., red
Signal generator Agilent 33250 Waveform generator for ultrasound source
Substrate for cell exposure compartment, SAT2 Ibidi µ-Dish 35mm
Substrate for cell exposure compartment, SAT3 Corning Transwell 6.5mm
Ultrasound source (SAT3) Sonic Concepts H107 with central hole Use of a HIFU-capable source allows pressures >1MPa to be generated both at the focus and pre-focally for expanded spatial coverage
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Gray, M., Vasilyeva, A. V., Brans, V., Stride, E. Studying Cavitation Enhanced Therapy. J. Vis. Exp. (170), e61989, doi:10.3791/61989 (2021).
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