in vitro腫瘍微小環境における免疫応答を解剖するためのマイクロ流体共培養モデル

実験分野としての医学のさまざまな分野の進化は、制御された条件下で細胞集団と臓器機能を操作する能力に依存してきました¹。そのような能力は、私たちの体で起こっているプロセスを再現できる測定可能なモデルの可用性にルーツがあります。

免疫療法と単一細胞ゲノムプロファイリング^の時代2において、がん生物学は、適切な時空間コンテキストで腫瘍と免疫のインターフェースを研究するために、新しいin vitroおよび計算モデルを利用する必要があります^2,3。

腫瘍微小環境⁴(TME)は、がん細胞が継続的に相互作用し、他の細胞(免疫細胞、間質細胞、内皮細胞)および非細胞(細胞外マトリックス、ECM)成分と動的に共進化する複雑な組織です。この複雑な状況の動的な性質は、免疫細胞が悪性細胞の味方または敵として果たすかどうかを決定し、したがって、疾患の進行と治療への反応の両方に強く影響します。今日、腫瘍免疫学者、バイオインフォマティシャン、およびシステム生物学の専門家による多大な努力が集まって、空間(すなわち、異なる腫瘍領域)および時間(すなわち、異なる腫瘍進行段階)^5,6のいずれかにおける癌の不^{均一性の臨床}的意義^5,6に対処し、単一細胞レベルで癌および免疫細胞の表現型および機能を特徴付けるために収束しています。この相乗効果の一例として、高度なコンピュータビジョン技術が、組織学的試料における免疫浸潤物の空間マッピングのために現在日常的に使用されている^7、8。

実験モデルの最前線では、動物実験と従来のin vitro法を橋渡しし、マイクロフルイディクスと共培養技術の進歩により、オルガノイド、マイクロ生理学的システム9,10,11(MPS)、臓器オンチップ^12,13,14などのさまざまなクラスのマイクロエンジニアリング細胞モデルにアクセスできます。 (OOC)。彼らは、細胞生態系の「全体像」のビューを拡大し、ハイコンテント顕微鏡¹⁵と画像処理アプローチを活用しながら、微小環境要因を制御するin vitroの可能性を拡大するという共通の特徴を共有しています。

今日、最先端のMPSおよびOOCシステムは、炎症性疾患、創傷治癒、粘膜免疫、毒素や日常の食品への反応などのさまざまなプロセスを調査および測定するために、既存の組織および共培養に免疫細胞のさまざまなサブタイプを組み込む免疫学的側面を含み始めています¹⁶。TMEオンチップモデル10、11、^12、13、^14、15、¹⁶、17は、灌流性マイクロ血管¹⁸、^19、20、²¹とも統合されており、細胞型依存性相互作用、物理的および化学的摂動^、および細胞毒性活性を調べるために開発されました。浸潤リンパ球²²、ならびに臨床的に関連する免疫調節剤²³。

ここでは、チップへの細胞のロードから画像処理ツールに至るまで、2D(セクション1)および3D(セクション2)設定¹⁶での高度な腫瘍免疫マイクロ流体共培養を活用するための汎用性の高いプロトコルを提供し、細胞機能の動的マルチパラメトリック²⁴モニタリングおよび視覚化と互換性があります。これは、フィジーのフリーウェアソフトウェアとそのツールボックス^25,26を利用して、サンプル管理とデータ分析の両方で使いやすさと柔軟性を維持しながら達成されます。

セクション1で説明したマイクロ流体デバイスは、付着性癌と浮遊免疫細胞の2D共培養を実行するように設計されています。このプラットフォームは、遺伝子変異²⁷ および/または免疫不全²⁸の存在下での免疫細胞の挙動のin vitro測定のために検証されました。ここでは、Trackmate(フィジーのソフトウェアに実装されているプラグイン)に基づく半自動方式を利用して、タイムラプス明視野画像で免疫細胞を追跡する手順を説明します。この手順は、免疫原性細胞死誘導因子 ²⁷ で処理されたか否かを標的とする癌細胞に対する免疫遊走²⁹および応答(すなわち、相互作用時間)の運動学的記述子の抽出を可能にする。

重要なことに、時系列画像から抽出されたこれらのパラメータは、高度な数学機械で処理できます。このアプローチの可能性の例として、私たちのグループは最近、確率過程と統計力学からの数学的方法に基づく分析を発表し、細胞ネットワークの特性をモデル化し、免疫細胞の挙動のパラメータ化された説明を提供します(すなわち、偏ったまたは無相関のランダムウォーク、高度にまたは協調していない運動^30,31)。

2番目のセクションで提供される3D設定は、共培養プロトコルに基づいており、細胞タイプと薬物の異なる組み合わせで2つのゲル領域に埋め込まれたより複雑な免疫適格TMEを競合的に再現します。ここでは、画像処理ステップは、異なる時点で、マトリゲル内で培養されたヒトA375Mメラノーマ細胞における染色免疫細胞の浸潤を測定し、抗腫瘍剤組合せ³²を評価するために説明する。A375M株は、高度に転移性の表現型を特徴とするA375P由来細胞株であり、免疫細胞の存在下でのそれらの転移能を評価するために選択された³²。

記載されたモデルは、異なる細胞源(マウスおよびヒト不死化または初代細胞株、オルガノイド、異種移植片など)に完全に準拠することができる。私たちの研究室の最近の研究では、ハイコンテントビデオ顕微鏡と画像分析を組み合わせることにより、競合する3Dレイアウトを適用して調査しました:i)抗腫瘍(抗体依存性細胞媒介性細胞傷害、ADCC)免疫応答と解剖HER2⁺ 乳がんオンチップモデル³³;ii)腫瘍回避およびT細胞の動員のメカニズムにおける骨髄系細胞(すなわち、癌関連マクロファージ)の作用³⁴;iii)コラーゲンマトリックス中の薬物処理された結腸癌細胞とともに培養されたインターフェロンα馴化樹状細胞(IFN-DC)に基づく免疫療法レジームの有効性、および効率的な運動とその後の食作用イベントを評価する³⁵;iv)IL−33処置または未処置のメラノーマ細胞³⁶に向かう骨髄由来好酸球の走化性遊走。

これらの高度なモデルは、がんの転移と耐性メカニズムにおける免疫コンテクスチャーの役割を理解するための観察ウィンドウとして役立つ可能性がありますが、調査結果を臨床に変換し、基礎研究とのギャップを埋めるための努力が必要です³⁷。

新たなシナリオとして、自動化されたハイコンテント顕微鏡の力と、より生理学的に関連性のあるマイクロシステムの使用を組み合わせることで、1つの実験キャンペーンから生成できる数百、さらには数千ギガバイトのマルチパラメトリックデータの処理、処理、解釈に新たな潜在的な課題が生じています。これは、OOC実験と人工知能38,39,40,41,42(AI)ベースのアルゴリズムとの直接的なリンクを意味し、高度な自動分析と、癌と免疫の相互作用のインシリコモデルを順番にフィードできる機能の生成⁴³、予測薬物スクリーニングアッセイの開発などのエキサイティングな新しいアプリケーション⁴⁴。

拡大し続ける取り組みの流れは、疾患モデルの設計と、単一細胞マルチオミクス読み出しを備えた大規模な摂動スクリーンを実装するための戦略の最適化に焦点を当てています。これは間違いなく、免疫疾患と癌の播種メカニズムに関する新しい洞察を得るための体系的な腫瘍免疫学オンチップアプローチの開発と、できれば適切な程度の方法の標準化を伴う臨床実装に役立つでしょう。