Modèles de co-culture microfluidique pour disséquer la réponse immunitaire dans des microenvironnements tumoraux in vitro

L’évolution des différentes branches de la médecine en tant que disciplines expérimentales a dépendu de la capacité à manipuler la population cellulaire et les fonctions des organes dans des conditions contrôlées¹. Une telle capacité a ses racines dans la disponibilité de modèles mesurables capables de récapituler les processus qui se produisent dans notre corps.

À l’ère de l’immunothérapie et du profilage génomique unicellulaire 2, la biologie du cancer doit tirer parti des modèles in vitro et informatiques émergents pour étudier l’interface tumorale-immunitaire dans un contexte spatio-temporel approprié ^2,3.

Le microenvironnement tumoral⁴ (TME) est un tissu complexe où les cellules cancéreuses interagissent continuellement et co-évoluent dynamiquement avec les autres composants cellulaires (cellules immunitaires, stromales et endothéliales) et non cellulaires (matrice extracellulaire, ECM). La nature dynamique de ce paysage complexe dicte si les cellules immunitaires jouent le rôle d’amies ou d’ennemies des cellules malignes, affectant ainsi fortement la progression de la maladie et la réponse au traitement. De nos jours, de grands efforts de la part des onco-immunologistes, des bioinformaticiens et des experts en biologie des systèmes convergent pour aborder la signification clinique de l’hétérogénéité du cancer 5,6, soit dans l’espace (c’est-à-dire dans des régions tumorales distinctes) et dans le temps (c’est-à-dire à des stades de progression tumorale distincts)^5,6, et pour caractériser le phénotype et la fonction du cancer et des cellules immunitaires au niveau d’une seule cellule. À titre d’exemple de cette synergie, des techniques avancées de vision par ordinateur sont maintenant couramment utilisées pour la cartographie spatiale de l’infiltrat immunitaire dans les échantillons histologiques ^7,8.

Sur le front des modèles expérimentaux, des études animales et des méthodes in vitro traditionnelles, les progrès de la microfluidique et des techniques de co-culture donnent accès à différentes classes de modèles cellulaires micro-modifiés tels que les organoïdes, les systèmes microphysiologiques 9,10,11 (MPS) et les organes sur puce^12,13,14 (OOC). Ils partagent le trait commun de zoomer sur la vue d’ensemble des écosystèmes cellulaires et d’élargir le potentiel in vitro de contrôle des facteurs microenvironnementaux tout en exploitant la microscopie à haut contenu¹⁵ et les approches de traitement d’images.

De nos jours, les systèmes MPS et OOC de pointe ont commencé à inclure des aspects immunologiques, incorporant différents sous-types de cellules immunitaires dans les tissus existants et les co-cultures, afin d’explorer et de mesurer une variété de processus tels que les maladies inflammatoires, la cicatrisation des plaies, l’immunité muqueuse et la réponse aux toxines ou aux produits alimentaires quotidiens¹⁶. Les modèles TME-on-a-chip 10,11,12,13,14,15,16,17, également intégrés à des microvaisseaux perfusables 18,19,20,21, ont été développés pour étudier les interactions dépendantes du type cellulaire, les perturbations physiques et chimiques et l’activité cytotoxique des lymphocytes infiltrants²², ainsi que des agents immunomodulateurs cliniquement pertinents²³.

Ici, nous fournissons des protocoles polyvalents, allant du chargement de cellules dans des puces à des outils de traitement d’image, pour exploiter des co-cultures microfluidiques avancées contre les tumeurs dans des paramètres 2D (section 1) et 3D (section 2)¹⁶, compatibles avec la surveillance et la visualisation dynamiques et multiparamétriques²⁴ des fonctions cellulaires. Ceci est réalisé en maintenant la facilité d’utilisation et la flexibilité à la fois dans la gestion des échantillons et l’analyse des données, en tirant parti du logiciel gratuit Fidji et de ses boîtes à outils^25,26.

Le dispositif microfluidique, décrit à la section 1, est conçu pour effectuer des co-cultures 2D de cancer adhérent et de cellules immunitaires flottantes. Cette plateforme a été validée pour la mesure in vitro du comportement des cellules immunitaires en présence de mutations génétiques²⁷ et/ou d’immunodéficiences²⁸. Ici, nous illustrons les étapes de suivi des cellules immunitaires dans des images en champ clair en accéléré, en exploitant une méthode semi-automatique basée sur Trackmate (un plugin implémenté dans le logiciel Fidji). Cette procédure permet d’extraire des descripteurs cinématiques de la migration immunitaire ²⁹ et de la réponse (c’est-à-dire des temps d’interaction) pour cibler les cellules cancéreuses, traitées ou non avec des inducteurs immunogènes de mort cellulaire²⁷.

Il est important de noter que ces paramètres, extraits d’images de séries chronologiques, peuvent être traités avec des machines mathématiques avancées. À titre d’exemple de la potentialité de cette approche, nos groupes ont récemment publié une analyse basée sur des méthodes mathématiques issues des processus stochastiques et de la mécanique statistique pour modéliser les propriétés du réseau cellulaire et fournir une description paramétrée du comportement des cellules immunitaires (c.-à-d. marche aléatoire biaisée ou non corrélée, mouvement hautement coordonné^{ou non 30,31}).

Le réglage 3D, fourni dans la deuxième section, est basé sur un protocole de co-culture pour recréer des TME immunocompétents plus complexes intégrés dans deux régions de gel avec différentes combinaisons de types de cellules et de médicaments de manière compétitive. Ici, les étapes de traitement d’images sont décrites pour mesurer, à différents moments, l’infiltration de cellules immunitaires colorées dans des cellules de mélanome A375M humaines cultivées au sein de Matrigel, pour évaluer des combinaisons d’agents antitumoraux³². La lignée A375M, une lignée cellulaire dérivée de l’A375P caractérisée par un phénotype hautement métastatique a été choisie pour évaluer leur capacité métastatique en présence de cellules immunitaires³².

Les modèles décrits peuvent être entièrement conformes à différentes sources cellulaires (lignées cellulaires immortalisées ou primaires murines et humaines, organoïdes, xénogreffes, entre autres). Dans des études récentes de notre laboratoire, en combinant la microscopie vidéo à haut contenu avec l’analyse d’images, la disposition 3D compétitive a été appliquée pour étudier: i) une réponse immunitaire antitumorale (cytotoxicité à médiation cellulaire dépendante des anticorps, ADCC) et disséquer le rôle des fibroblastes dans la résistance au traitement par trastuzumab dans les modèles sur puce de cancer du sein HER2^{+ 33}; ii) l’action des cellules myéloïdes (c’est-à-dire des macrophages associés au cancer) dans les mécanismes d’évasion tumorale et de recrutement des lymphocytes T³⁴; iii) l’efficacité des régimes immunothérapeutiques, spécifiquement basés sur des cellules dendritiques conditionnées par l α’interféron (IFN-DC), cultivées avec des cellules cancéreuses du côlon traitées par des médicaments dans des matrices de collagène, et pour évaluer l’efficacité du mouvement et les événements de phagocytose qui en découlent³⁵; iv) la migration chimiotactique des éosinophiles dérivés de la moelle osseuse vers les cellules de mélanome traitées ou non traitées par IL-33³⁶.

Ces modèles avancés pourraient servir de fenêtres d’observation pour comprendre le rôle de la contexture immunitaire dans les métastases cancéreuses et les mécanismes de résistance, mais des efforts sont nécessaires pour traduire les résultats dans les cliniques, comblant ainsi l’écart avec la recherche fondamentale³⁷.

En tant que scénario émergent, l’exploitation de la puissance de la microscopie automatisée à haut contenu couplée à l’utilisation de microsystèmes plus pertinents sur le plan physiologique ouvre de nouveaux défis potentiels pour la manipulation, le traitement et l’interprétation de centaines, voire de milliers, de gigaoctets de données multiparamétriques, qui peuvent être générées à partir d’une seule campagne expérimentale. Cela implique un lien direct entre les expériences OOC et les algorithmes basés sur l’intelligence artificielle 38,39,40,41,42 (IA) à la fois pour l’analyse automatisée avancée et la génération de fonctionnalités qui peuvent alimenter à leur tour des modèles in silico d’interaction cancer-immunité 43, avec de nouvelles applications passionnantes à l’horizon^, telles que le développement de tests prédictifs de dépistage de médicaments ⁴⁴.

Un flux d’efforts sans cesse croissant est axé sur la conception de modèles de maladies conjointement avec l’optimisation des stratégies pour mettre en œuvre les criblages de perturbation à grande échelle avec des lectures multi-omiques unicellulaires. Cela contribuera sans aucun doute au développement et, espérons-le, à la mise en œuvre clinique, accompagnée d’un degré approprié de normalisation des méthodes, d’une approche systématique onco-immunologie sur puce pour acquérir de nouvelles connaissances sur les troubles immunitaires et les mécanismes de dissémination du cancer.