Microfluïdische co-cultuurmodellen voor het ontleden van de immuunrespons in in vitro tumormicro-omgevingen

De evolutie van verschillende takken van de geneeskunde als experimentele disciplines is afhankelijk geweest van het vermogen om celpopulatie en orgaanfuncties onder gecontroleerde omstandigheden te manipuleren¹. Een dergelijk vermogen heeft zijn wortels in de beschikbaarheid van meetbare modellen die in staat zijn om processen in ons lichaam samen te vatten.

In het tijdperk van immunotherapie en eencellige genomische profilering 2, moet de kankerbiologie profiteren van opkomende in vitro en computationele modellen voor het onderzoeken van de tumor-immuuninterface in een juiste spatiotemporale context ^2,3.

De tumor micro-omgeving⁴ (TME) is een complex weefsel waar kankercellen continu interageren en dynamisch co-evolueren met de andere cellulaire (immuun-, stromale en endotheelcellen) en niet-cellulaire (de extracellulaire matrix, ECM) componenten. De dynamische aard van dit complexe landschap bepaalt of immuuncellen spelen als vrienden of vijanden van kwaadaardige cellen, waardoor zowel de ziekteprogressie als de respons op therapie sterk worden beïnvloed. Tegenwoordig komen grote inspanningen van onco-immunologen, bio-informatici en systeembiologische experts samen om de klinische betekenis van heterogeniteit van kanker 5,6 aan te pakken, hetzij in de ruimte (d.w.z. in verschillende tumorgebieden) en tijd (d.w.z. in verschillende tumorprogressiestadia)^5,6, en om het fenotype en de functie van kanker en immuuncellen op eencellig niveau te karakteriseren. Als voorbeeld van deze synergie worden geavanceerde computervisietechnieken nu routinematig gebruikt voor het ruimtelijk in kaart brengen van immuuninfiltraat in histologische monsters ^7,8.

Aan de voorkant van experimentele modellen, overbruggingsdierstudies en traditionele in vitro-methoden, geven ontwikkelingen in microfluïdica en co-kweektechnieken toegang tot verschillende klassen van micro-engineered cellulaire modellen zoals organoïden, microfysiologische systemen 9,10,11 (MPS) en organen-op-chip^12,13,14 (OOC). Ze delen de gemeenschappelijke eigenschap om in te zoomen op het ‘grote plaatje’ van de cellulaire ecosystemen en het in vitro potentieel uit te breiden om micro-omgevingsfactoren te beheersen, terwijl ze gebruik maken van microscopie¹⁵ met een hoog gehalte en beeldverwerkingsbenaderingen.

Tegenwoordig zijn state-of-the-art MPS- en OOC-systemen begonnen immunologische aspecten op te nemen , waarbij verschillende subtypen immuuncellen in bestaande weefsels en co-culturen worden opgenomen, zodat een verscheidenheid aan processen zoals ontstekingsziekten, wondgenezing, mucosale immuniteit en reactie op toxines of dagelijkse voedingsproducten wordt onderzocht en gemeten¹⁶. TME-on-a-chip modellen 10,11,12,13,14,15,16,17, ook geïntegreerd met perfuseerbare microvessels 18,19,20,21, zijn ontwikkeld om celtype-afhankelijke interacties, fysische en chemische verstoringen en de cytotoxische activiteit van infiltrerende lymfocyten²², evenals klinisch relevante immunomodulerende middelen²³.

Hier bieden we veelzijdige protocollen, variërend van het laden van cellen in chips tot beeldverwerkingstools, om geavanceerde tumor-immuun microfluïdische coculturen te benutten in 2D (sectie 1) en 3D (sectie 2) instellingen¹⁶, compatibel met dynamische, multiparametrische²⁴ monitoring en visualisatie van cellulaire functies. Dit wordt bereikt met behoud van gebruiksgemak en flexibiliteit, zowel in monsterbeheer als gegevensanalyse, gebruikmakend van Fiji freeware-software en zijn toolboxen^25,26.

Het microfluïdische apparaat, beschreven in sectie 1, is ontworpen om 2D-coculturen van aanhangende kanker en zwevende immuuncellen uit te voeren. Dit platform werd gevalideerd voor de in vitro meting van het gedrag van immuuncellen in aanwezigheid van genetische mutaties²⁷ en/of immunodeficiënties²⁸. Hier illustreren we stappen voor het volgen van immuuncellen in time-lapse bright-field-afbeeldingen, door gebruik te maken van een semi-automatische methode op basis van Trackmate (een plug-in geïmplementeerd in Fiji-software). Deze procedure maakt de extractie mogelijk van kinematische descriptoren van immuunmigratie ²⁹ en respons (d.w.z. interactietijden) om kankercellen te targeten, al dan niet behandeld met immunogene celdoodinductoren²⁷.

Belangrijk is dat deze parameters, geëxtraheerd uit tijdreeksafbeeldingen, kunnen worden verwerkt met geavanceerde wiskundige machines. Als voorbeeld van de potentie van deze benadering publiceerden onze groepen onlangs een analyse op basis van wiskundige methoden van stochastische processen en statistische mechanica om cellulaire netwerkeigenschappen te modelleren en een geparametriseerde beschrijving van immuuncelgedrag te geven (d.w.z. bevooroordeelde of niet-gecorreleerde willekeurige wandeling, sterk of niet gecoördineerde beweging^30,31).

De 3D-instelling, die in de tweede sectie wordt verstrekt, is gebaseerd op een co-cultuurprotocol om complexere immunocompetente TME’s ingebed in twee gelregio’s met verschillende combinaties van celtypen en geneesmiddelen op een concurrerende manier te recreëren. Hier worden beeldverwerkingsstappen beschreven om, op verschillende tijdstippen, de infiltratie van gekleurde immuuncellen in menselijke A375M-melanoomcellen gekweekt in Matrigel te meten, om antitumormiddelcombinaties te evalueren³². A375M-lijn, een van A375P afgeleide cellijn gekenmerkt door een sterk gemetastaseerd fenotype, werd gekozen om hun metastatische vermogen te evalueren in de aanwezigheid van immuuncellen³².

De beschreven modellen kunnen volledig compatibel zijn met verschillende celbronnen (murine en menselijke vereeuwigde of primaire cellijnen, organoïden, xenografts, onder de anderen). In recente studies van ons lab, door high-content videomicroscopie te combineren met beeldanalyse, werd de competitieve 3D-lay-out toegepast om te onderzoeken: i) een anti-tumorale (antilichaam-afhankelijke cel-gemedieerde cytotoxiciteit, ADCC) immuunrespons en ontleed de rol van fibroblasten in resistentie tegen trastuzumab-therapie in HER2 ⁺ borstkanker on-chip modellen³³; ii) de werking van myeloïde cellen (d.w.z. kanker-geassocieerde macrofagen) in mechanismen van tumorontwijking en rekrutering van T-cellen³⁴; iii) de werkzaamheid van immunotherapeutische regimes, specifiek gebaseerd op interferon-α-geconditioneerde dendritische cellen (IFN-DC’s), gekweekt met met geneesmiddelen behandelde darmkankercellen in collageenmatrices, en om efficiënte beweging en de daaropvolgende fagocytosegebeurtenissen te evalueren³⁵; iv) de chemotactische migratie van van beenmerg afgeleide eosinofielen naar met IL-33 behandelde of onbehandelde melanoomcellen³⁶.

Deze geavanceerde modellen kunnen dienen als observatievensters voor het begrijpen van de rol van immuuncontexten bij kankermetastase en resistentiemechanismen, maar er zijn inspanningen nodig om bevindingen naar de klinieken te vertalen en de kloof met fundamenteel onderzoek te dichten³⁷.

Als een opkomend scenario, het benutten van de kracht van geautomatiseerde high-content microscopie gekoppeld aan het gebruik van meer fysiologisch relevante microsystemen opent nieuwe potentiële uitdagingen voor de verwerking, verwerking en interpretatie van honderden, en zelfs duizenden, Gigabytes aan multiparametrische gegevens, die kunnen worden gegenereerd uit een enkele experimentele campagne. Dit impliceert een directe koppeling van OOC-experimenten met kunstmatige intelligentie 38,39,40,41,42 (AI)-gebaseerde algoritmen, zowel voor geavanceerde geautomatiseerde analyse als voor het genereren van functies die op hun beurt kunnen worden gevoed in silico-modellen van kanker-immuun samenspel 43, met spannende nieuwe toepassingen aan de horizon^, zoals de ontwikkeling van voorspellende medicijnscreeningtests ⁴⁴.

Een steeds groter wordende stroom van inspanningen is gericht op het ontwerp van ziektemodellen samen met de optimalisatie van strategieën om de grootschalige perturbatieschermen met eencellige multi-omics-uitlezingen te implementeren. Dit zal ongetwijfeld helpen bij de ontwikkeling en, hopelijk, de klinische implementatie, vergezeld van een passende mate van methodestandaardisatie, van een systematische onco-immunologie-op-een-chip-benadering om nieuwe inzichten te verkrijgen in immuunstoornissen en kankerverspreidingsmechanismen.