Modelli di co-coltura microfluidica per la dissezione della risposta immunitaria in microambienti tumorali in vitro

L’evoluzione di diverse branche della medicina come discipline sperimentali è dipesa dalla capacità di manipolare la popolazione cellulare e le funzioni degli organi in condizioni controllate¹. Tale capacità ha le sue radici nella disponibilità di modelli misurabili in grado di ricapitolare i processi che avvengono nel nostro corpo.

Nell’era dell’immunoterapia e del profilo genomico unicellulare 2, la biologia del cancro deve trarre vantaggio dai modelli emergenti in vitro e computazionali per studiare l’interfaccia tumore-immunità in un contesto spaziotemporale appropriato ^2,3.

Il microambiente tumorale⁴ (TME) è un tessuto complesso in cui le cellule tumorali interagiscono continuamente e co-evolvono dinamicamente con le altre componenti cellulari (cellule immunitarie, stromali ed endoteliali) e non cellulari (matrice extracellulare, ECM). La natura dinamica di questo complesso paesaggio determina se le cellule immunitarie giocano come amiche o nemiche delle cellule maligne, influenzando così fortemente sia la progressione della malattia che la risposta alla terapia. Al giorno d’oggi, grandi sforzi da parte di onco-immunologi, bioinformatici ed esperti di biologia dei sistemi stanno convergendo per affrontare il significato clinico dell’eterogeneità del cancro 5,6, sia nello spazio (cioè in regioni tumorali distinte) che nel tempo (cioè in fasi distinte di progressione tumorale)^5,6, e per caratterizzare il cancro e il fenotipo e la funzione delle cellule immunitarie a livello di singola cellula. Come esempio di questa sinergia, tecniche avanzate di visione artificiale sono ora utilizzate di routine per la mappatura spaziale degli infiltrati immunitari nei campioni istologici ^7,8.

Sul fronte dei modelli sperimentali, collegando gli studi sugli animali e i metodi tradizionali in vitro, i progressi nella microfluidica e nelle tecniche di co-coltura danno accesso a diverse classi di modelli cellulari microingegnerizzati come organoidi, sistemi microfisiologici 9,10,11 (MPS) e organi-on-chip^12,13,14 (OOC). Condividono il tratto comune di ingrandire la visione “d’insieme” degli ecosistemi cellulari e di espandere il potenziale in vitro per controllare i fattori microambientali sfruttando al contempo la microscopia ad alto contenuto¹⁵ e gli approcci di elaborazione delle immagini.

Al giorno d’oggi, i sistemi MPS e OOC all’avanguardia hanno iniziato a includere aspetti immunologici , incorporando diversi sottotipi di cellule immunitarie in tessuti e co-colture esistenti, in modo da esplorare e misurare una varietà di processi come malattie infiammatorie, guarigione delle ferite, immunità mucosale e risposta alle tossine o prodotti alimentari quotidiani¹⁶. I modelli TME-on-a-chip 10,11,12,13,14,15,16,17, anch’essi integrati con microvasi perfusibili 18,19,20,21, sono stati sviluppati per studiare le interazioni dipendenti dal tipo di cellula, le perturbazioni fisiche e chimiche e l’attività citotossica di linfociti infiltranti²², nonché agenti immunomodulatori clinicamente rilevanti²³.

Qui, forniamo protocolli versatili, che vanno dal caricamento delle cellule nei chip agli strumenti di elaborazione delle immagini, per sfruttare co-colture microfluidiche avanzate tumore-immune in impostazioni 2D (sezione 1) e 3D (sezione 2)¹⁶, compatibili con il monitoraggio dinamico e multiparametrico²⁴ e la visualizzazione delle funzioni cellulari. Ciò si ottiene mantenendo la facilità d’uso e la flessibilità sia nella gestione dei campioni che nell’analisi dei dati, sfruttando il software freeware delle Fiji e le sue cassette degli attrezzi^25,26.

Il dispositivo microfluidico, descritto nella sezione 1, è progettato per eseguire co-colture 2D di cancro aderente e cellule immunitarie galleggianti. Questa piattaforma è stata validata per la misurazione in vitro del comportamento delle cellule immunitarie in presenza di mutazioni genetiche²⁷ e/o immunodeficienze²⁸. Qui, illustriamo i passaggi per tracciare le cellule immunitarie nelle immagini time-lapse in campo chiaro, sfruttando un metodo semi-automatico basato su Trackmate (un plugin implementato nel software Fiji). Questa procedura consente l’estrazione di descrittori cinematici della migrazione immunitaria ²⁹ e della risposta (cioè dei tempi di interazione) alle cellule tumorali bersaglio, trattate o meno con induttori di morte cellulare immunogenica²⁷.

È importante sottolineare che questi parametri, estratti da immagini di serie temporali, possono essere elaborati con macchinari matematici avanzati. Come esempio della potenzialità di questo approccio, i nostri gruppi hanno recentemente pubblicato un’analisi basata su metodi matematici dai processi stocastici e dalla meccanica statistica per modellare le proprietà della rete cellulare e fornire una descrizione parametrizzata del comportamento delle cellule immunitarie (cioè, camminata casuale distorta o non correlata, movimento altamente o non coordinato^30,31).

L’impostazione 3D, fornita nella seconda sezione, si basa su un protocollo di co-coltura per ricreare TME immunocompetenti più complesse incorporate in due regioni di gel con diverse combinazioni di tipi cellulari e farmaci in modo competitivo. Qui, vengono descritte le fasi di elaborazione delle immagini per misurare, in diversi punti temporali, l’infiltrazione di cellule immunitarie colorate in cellule di melanoma umano A375M coltivate all’interno di Matrigel, per valutare le combinazioni di agenti antitumorali³². A375M, una linea cellulare derivata da A375P caratterizzata da un fenotipo altamente metastatico, è stata scelta per valutare la loro capacità metastatica in presenza di cellule immunitarie³².

I modelli descritti possono essere pienamente compatibili con diverse fonti cellulari (linee cellulari murine e umane immortalizzate o primarie, organoidi, xenotrapianti, tra gli altri). In recenti studi del nostro laboratorio, combinando la microscopia video ad alto contenuto con l’analisi delle immagini, il layout 3D competitivo è stato applicato per indagare: i) una risposta immunitaria antitumorale (citotossicità cellulo-mediata anticorpo-dipendente, ADCC) e sezionare il ruolo dei fibroblasti nella resistenza alla terapia con trastuzumab in modelli on-chip di carcinoma mammario HER2^{+ 33}; ii) l’azione delle cellule mieloidi (cioè dei macrofagi associati al cancro) nei meccanismi di evasione tumorale e di reclutamento delle cellule T³⁴; iii) l’efficacia di regimi immunoterapeutici, specificamente basati su cellule dendritiche (IFN-DC) condizionate da interferone α, coltivate con cellule tumorali del colon trattate con farmaci in matrici di collagene, e la valutazione del movimento efficiente e dei successivi eventi di fagocitosi³⁵; iv) la migrazione chemiotattica di eosinofili derivati dal midollo osseo verso cellule di melanoma trattate o non trattate con IL-33³⁶.

Questi modelli avanzati potrebbero servire come finestre di osservazione per comprendere il ruolo del contesto immunitario nelle metastasi del cancro e nei meccanismi di resistenza, ma sono necessari sforzi per tradurre i risultati nelle cliniche, colmando il divario con la ricerca di base³⁷.

Come scenario emergente, sfruttare la potenza della microscopia automatizzata ad alto contenuto accoppiata all’uso di microsistemi più fisiologicamente rilevanti sta aprendo nuove potenziali sfide per la gestione, l’elaborazione e l’interpretazione di centinaia, e persino migliaia, di gigabyte di dati multiparametrici, che possono essere generati da una singola campagna sperimentale. Ciò implica un collegamento diretto degli esperimenti OOC con algoritmi basati sull’intelligenza artificiale 38,39,40,41,42 (AI) sia per l’analisi automatizzata avanzata, sia per la generazione di funzionalità che possono alimentare a loro volta modelli in silico di interazione cancro-immunità 43, con nuove entusiasmanti applicazioni all’orizzonte^, come lo sviluppo di saggi predittivi di screening farmacologico ⁴⁴.

Un flusso di sforzi in continua espansione è focalizzato sulla progettazione di modelli di malattia congiuntamente all’ottimizzazione delle strategie per implementare gli schermi di perturbazione su larga scala con letture multi-omiche a cella singola. Ciò aiuterà senza dubbio lo sviluppo e, si spera, l’implementazione clinica, accompagnata da un adeguato grado di standardizzazione del metodo, di un approccio sistematico onco-immunology-on-a-chip per ottenere nuove informazioni sui disturbi immunitari e sui meccanismi di diffusione del cancro.