Mikrofluidische Co-Kulturmodelle zur Analyse der Immunantwort in in vitro Tumormikroumgebungen

Die Entwicklung verschiedener Zweige der Medizin als experimentelle Disziplinen hing von der Fähigkeit ab, Zellpopulationen und Organfunktionen unter kontrollierten Bedingungen zu manipulieren¹. Diese Fähigkeit hat ihre Wurzeln in der Verfügbarkeit messbarer Modelle, die in der Lage sind, Prozesse in unserem Körper zu rekapitulieren.

Im Zeitalter der Immuntherapie und des Einzelzell-Genom-Profilings 2 muss die Krebsbiologie die Vorteile neuer In-vitro- und Computermodelle nutzen, um die Tumor-Immun-Schnittstelle in einem geeigneten raumzeitlichen Kontext zu untersuchen ^2,3.

Die Tumormikroumgebung⁴ (TME) ist ein komplexes Gewebe, in dem Krebszellen kontinuierlich mit den anderen zellulären (Immun-, Stroma- und Endothelzellen) und nichtzellulären (extrazelluläre Matrix, EZM) Komponenten interagieren und sich dynamisch weiterentwickeln. Die Dynamik dieser komplexen Landschaft bestimmt, ob Immunzellen als Freund oder Feind bösartiger Zellen fungieren, und beeinflusst so sowohl das Fortschreiten der Krankheit als auch das Ansprechen auf die Therapie stark. Heutzutage laufen große Anstrengungen von Onkoimmunologen, Bioinformatikern und Experten für Systembiologie zusammen, um die klinische Bedeutung der Krebsheterogenität 5,6 entweder räumlich (d. h. in verschiedenen Tumorregionen) und zeitlich (d. h. in unterschiedlichen Tumorprogressionsstadien)^5,6 zu untersuchen und den Phänotyp und die Funktion von Krebs- und Immunzellen auf Einzelzellebene zu charakterisieren. Als Beispiel für diese Synergie werden heute routinemäßig fortschrittliche Computer-Vision-Techniken für die räumliche Kartierung von Immuninfiltrat in histologischen Proben eingesetzt ^7,8.

Neben experimentellen Modellen, die Tierversuche und traditionelle In-vitro-Methoden überbrücken, ermöglichen Fortschritte in der Mikrofluidik und Co-Kultivierungstechniken den Zugang zu verschiedenen Klassen von mikrotechnischen Zellmodellen wie Organoiden, mikrophysiologischen Systemen 9,10,11 (MPS) und Organs-on-Chip^12,13,14 (OOC). Sie haben die gemeinsame Eigenschaft, das “große Ganze” der zellulären Ökosysteme zu vergrößern und das In-vitro-Potenzial zur Kontrolle von Mikroumgebungsfaktoren zu erweitern, während gleichzeitig High-Content-Mikroskopie¹⁵ und Bildverarbeitungsansätze genutzt werden.

Heutzutage haben hochmoderne MPS- und OOC-Systeme begonnen, immunologische Aspekte einzubeziehen und verschiedene Subtypen von Immunzellen in bestehende Gewebe- und Co-Kulturen einzubauen, um eine Vielzahl von Prozessen wie entzündliche Erkrankungen, Wundheilung, Schleimhautimmunität und Reaktion auf Toxine oder tägliche Nahrungsmittel zu erforschen und zu messen¹⁶. Die TME-on-a-Chip-Modelle 10,11,12,13,14,15,16,17, die auch in die perfusierbaren Mikrogefäße 18,19,20,21 integriert sind, wurden entwickelt, um zelltypabhängige Wechselwirkungen, physikalische und chemische Störungen sowie die zytotoxische Aktivität von infiltrierende Lymphozyten²² sowie klinisch relevante immunmodulatorische Wirkstoffe²³.

Hier bieten wir vielseitige Protokolle an, die von Ladezellen in Chips bis hin zu Bildverarbeitungswerkzeugen reichen, um fortschrittliche mikrofluidische Tumor-Immun-Co-Kulturen in 2D- (Abschnitt 1) und 3D- (Abschnitt 2) Umgebungen¹⁶ zu nutzen, die mit der dynamischen, multiparametrischen^{24-Überwachung} und Visualisierung zellulärer Funktionen kompatibel sind. Dies wird unter Beibehaltung der Benutzerfreundlichkeit und Flexibilität sowohl bei der Probenverwaltung als auch bei der Datenanalyse erreicht, wobei die Vorteile der Fidschi-Freeware-Software und ihrer Toolboxen^{genutzt werden 25,26}.

Die in Abschnitt 1 beschriebene mikrofluidische Vorrichtung ist für die Durchführung von 2D-Kokulturen von adhärenten Krebs- und schwebenden Immunzellen ausgelegt. Diese Plattform wurde für die in vitro Messung des Verhaltens von Immunzellen in Gegenwart genetischer Mutationen²⁷ und/oder Immundefekte²⁸ validiert. Hier veranschaulichen wir Schritte zur Verfolgung von Immunzellen in Zeitraffer-Hellfeldbildern, indem wir eine halbautomatische Methode nutzen, die auf Trackmate (einem in Fidschi-Software implementierten Plugin) basiert. Dieses Verfahren ermöglicht die Extraktion kinematischer Deskriptoren der Immunmigration ²⁹ und der Reaktion (d. h. der Interaktionszeiten) auf Krebszellen, die mit immunogenen Zelltod-Induktoren behandelt wurden oder nicht²⁷.

Wichtig ist, dass diese Parameter, die aus Zeitreihenbildern extrahiert werden, mit fortschrittlichen mathematischen Maschinen verarbeitet werden können. Als Beispiel für die Potenzialität dieses Ansatzes haben unsere Gruppen kürzlich eine Analyse veröffentlicht, die auf mathematischen Methoden aus stochastischen Prozessen und statistischer Mechanik basiert, um zelluläre Netzwerkeigenschaften zu modellieren und eine parametrisierte Beschreibung des Verhaltens von Immunzellen zu liefern (d.h. verzerrter oder unkorrelierter Random Walk, hochgradig oder nicht koordinierte Bewegung^30,31).

Die 3D-Einstellung, die im zweiten Abschnitt vorgestellt wird, basiert auf einem Co-Kultur-Protokoll, um komplexere immunkompetente TMEs, die in zwei Gelregionen mit unterschiedlichen Kombinationen von Zelltypen und Medikamenten eingebettet sind, wettbewerbsfähig nachzubilden. Hier werden Bildverarbeitungsschritte beschrieben, um zu verschiedenen Zeitpunkten die Infiltration von gefärbten Immunzellen in humanen A375M-Melanomzellen, die in Matrigel kultiviert werden, zu messen, um Antitumorwirkstoffkombinationen zu bewerten³². Die A375M-Linie, eine von A375P abgeleitete Zelllinie, die durch einen stark metastasierten Phänotyp gekennzeichnet ist, wurde ausgewählt, um ihre Metastasierungsfähigkeit in Gegenwart von Immunzellen zu bewerten³².

Die beschriebenen Modelle können vollständig mit verschiedenen Zellquellen (murine und humane immortalisierte oder primäre Zelllinien, Organoide, Xenotransplantate usw.) kompatibel sein. In neueren Studien unseres Labors wurde durch die Kombination von High-Content-Videomikroskopie mit Bildanalyse das kompetitive 3D-Layout angewendet, um Folgendes zu untersuchen: i) eine antitumorale (antikörperabhängige zellvermittelte Zytotoxizität, ADCC) Immunantwort und die Rolle von Fibroblasten bei der Resistenz gegen die Trastuzumab-Therapie in HER2⁺ Brustkrebs-On-Chip-Modellen^{zu untersuchen 33}; ii) die Wirkung myeloischer Zellen (d.h. krebsassoziierter Makrophagen) bei Mechanismen der Tumorevasion und Rekrutierung von T-Zellen³⁴; iii) die Wirksamkeit von immuntherapeutischen Regimen, die speziell auf Interferon-α-konditionierten dendritischen Zellen (IFN-DCs) basieren, die mit medikamentös behandelten Darmkrebszellen in Kollagenmatrizen kultiviert werden, und zur Bewertung der effizienten Bewegung und der nachfolgenden Phagozytoseereignisse³⁵; iv) die chemotaktische Migration von aus dem Knochenmark stammenden Eosinophilen zu IL-33-behandelten oder unbehandelten Melanomzellen³⁶.

Diese fortschrittlichen Modelle könnten als Beobachtungsfenster dienen, um die Rolle der Immunkontexture bei Krebsmetastasen und Resistenzmechanismen zu verstehen, aber es sind Anstrengungen erforderlich, um die Ergebnisse in die Kliniken zu übertragen und die Lücke zur Grundlagenforschung zu schließen³⁷.

Die Nutzung der Leistungsfähigkeit der automatisierten High-Content-Mikroskopie in Verbindung mit der Verwendung physiologisch relevanterer Mikrosysteme eröffnet neue potenzielle Herausforderungen für die Handhabung, Verarbeitung und Interpretation von Hunderten und sogar Tausenden von Gigabyte multiparametrischer Daten, die aus einer einzigen experimentellen Kampagne generiert werden können. Dies impliziert eine direkte Verbindung von OOC-Experimenten mit KI-basierten Algorithmen der künstlichen Intelligenz 38,39,40,41,42 (KI) sowohl für die fortgeschrittene automatisierte Analyse als auch für die Generierung von Merkmalen, die wiederum in silico-Modelle des Krebs-Immun-Zusammenspiels⁴³ einfließen können, mit aufregenden neuen Anwendungen am Horizont^, wie z. B.^der Entwicklung von prädiktiven Wirkstoff-Screening-Assays ⁴⁴.

Ein ständig wachsender Fluss von Anstrengungen konzentriert sich auf die Entwicklung von Krankheitsmodellen zusammen mit der Optimierung von Strategien zur Implementierung der groß angelegten Störungsbildschirme mit Einzelzell-Multi-Omics-Auslesungen. Dies wird zweifellos dazu beitragen, einen systematischen Onko-Immunologie-on-a-Chip-Ansatz zu entwickeln und hoffentlich auch klinisch umzusetzen, begleitet von einem angemessenen Grad an Methodenstandardisierung, um neue Einblicke in Immunerkrankungen und Krebsverbreitungsmechanismen zu gewinnen.