Modelos de Co-Cultura Microfluídica para Dissecar a Resposta Imune em Microambientes Tumorais in vitro

A evolução de diferentes ramos da medicina como disciplinas experimentais tem dependido da capacidade de manipular a população celular e as funções dos órgãos sob condições controladas¹. Tal habilidade tem suas raízes na disponibilidade de modelos mensuráveis capazes de recapitular processos que acontecem em nosso corpo.

Na era da imunoterapia e do perfil genômico de célula única2, a biologia do câncer precisa aproveitar modelos emergentes in vitro e computacionais para investigar a interface tumor-imune em um contexto espaço-temporal ^adequado2,3.

O microambiente tumoral⁴ (TME) é um tecido complexo onde as células cancerosas interagem continuamente e co-evoluem dinamicamente com os outros componentes celulares (imunes, estromais e endoteliais) e não celulares (matriz extracelular, MEC). A natureza dinâmica desse cenário complexo dita se as células imunes jogam como amigas ou inimigas das células malignas, afetando fortemente tanto a progressão da doença quanto a resposta à terapia. Atualmente, grandes esforços de onco-imunologistas, bioinformáticos e especialistas em biologia de sistemas estão convergindo para abordar o significado clínico da heterogeneidade do^câncer5,6, seja no espaço (isto é, em regiões tumorais distintas) e no tempo (isto é, em estágios distintos de progressão tumoral)^5,6, e para caracterizar o fenótipo e a função do câncer e das células imunes em nível unicelular. Como exemplo dessa sinergia, técnicas avançadas de visão computacional são atualmente utilizadas rotineiramente para mapeamento espacial do infiltrado imune em amostras histológicas ^7,8.

Na frente dos modelos experimentais, unindo estudos em animais e métodos tradicionais in vitro, os avanços na microfluídica e nas técnicas de co-cultivo dão acesso a diferentes classes de modelos celulares micro-projetados, como organoides, sistemas microfisiológicos 9,10,11 (MPS) e organs-on-chip^12,13,14 (OOC). Eles compartilham a característica comum de ampliar a visão “global” dos ecossistemas celulares e expandir o potencial in vitro para controlar fatores microambientais, explorando abordagens de microscopia de alto conteúdo¹⁵ e processamento de imagens.

Atualmente, os sistemas MPS e OOC de última geração começaram a incluir aspectos imunológicos, incorporando diferentes subtipos de células imunes em tecidos e coculturas existentes, de modo a explorar e medir uma variedade de processos, como doenças inflamatórias, cicatrização de feridas, imunidade da mucosa e resposta a toxinas ou produtos alimentares diários¹⁶. Os modelos TME-on-a-chip 10,11,12,13,14,15,16,17, também integrados com microvasos perfusíveis 18,19,20,21, foram desenvolvidos para investigar interações célula-tipo-dependente, perturbações físicas e químicas, e a atividade citotóxica de linfócitos infiltrantes²², bem como agentes imunomoduladores clinicamente relevantes²³.

Aqui, fornecemos protocolos versáteis, abrangendo desde o carregamento de células em chips até ferramentas de processamento de imagens, para explorar coculturas microfluídicas avançadas imunes a tumores em configurações 2D (seção 1) e 3D (seção 2)¹⁶, compatíveis com monitoramento dinâmico e multiparamétrico²⁴ e visualização de funções celulares. Isso é conseguido mantendo a facilidade de uso e flexibilidade tanto no gerenciamento de amostras quanto na análise de dados, aproveitando o software gratuito Fiji e suas caixas de ferramentas^25,26.

O dispositivo microfluídico, descrito na seção 1, é projetado para realizar co-culturas 2D de células imunes aderentes e cancerosas flutuantes. Essa plataforma foi validada para a mensuração in vitro do comportamento de células imunes na presença de mutações genéticas²⁷ e/ou imunodeficiências²⁸. Aqui, ilustramos etapas para rastrear células imunes em imagens de campo brilhante de lapso de tempo, explorando um método semiautomático baseado no Trackmate (um plugin implementado no software Fiji). Esse procedimento permite a extração de descritores cinemáticos de migração imune29 e resposta (i.e., tempos de interação) a células-alvo cancerosas, tratadas ou não com indutores de morte celular ^{imunogênica27}.

É importante ressaltar que esses parâmetros, extraídos de imagens de séries temporais, podem ser processados com maquinário matemático avançado. Como exemplo da potencialidade dessa abordagem, nossos grupos publicaram recentemente uma análise baseada em métodos matemáticos de processos estocásticos e mecânica estatística para modelar propriedades de redes celulares e fornecer uma descrição parametrizada do comportamento das células imunes (isto é, passeio aleatório tendencioso ou não correlacionado, movimento altamente coordenado^{ou não coordenado 30,31}).

A configuração 3D, fornecida na segunda seção, é baseada em um protocolo de co-cultura para recriar TMEs imunocompetentes mais complexas embutidas em duas regiões de gel com diferentes combinações de tipos celulares e drogas de forma competitiva. Aqui, são descritas etapas do processamento das imagens para medir, em diferentes momentos, a infiltração de células imunes coradas em células humanas de melanoma A375M cultivadas dentro de Matrigel, para avaliar combinações de agentes antitumorais³². A linhagem A375M, uma linhagem celular derivada do A375P caracterizada por um fenótipo altamente metastático, foi escolhida para avaliar sua capacidade metastática na presença de células imunes³².

Os modelos descritos podem ser totalmente compatíveis com diferentes fontes celulares (linhagens celulares primárias ou imortalizadas murinas e humanas, organoides, xenoenxertos, entre outras). Em estudos recentes de nosso laboratório, combinando videomicroscopia de alto conteúdo com análise de imagem, o layout 3D competitivo foi aplicado para investigar: i) uma resposta imune antitumoral (citotoxicidade mediada por células dependentes de anticorpos, ADCC) e dissecar o papel dos fibroblastos na resistência à terapia com trastuzumabe em modelos on-chip de câncer de mama HER2^{+ 33}; ii) a ação das células mieloides (macrófagos associados ao câncer) nos mecanismos de evasão tumoral e recrutamento de células^T34; iii) a eficácia de regimes imunoterápicos, especificamente baseados em células dendríticas condicionadas por interferon α (IFN-DCs), cultivadas com células de câncer de cólon tratadas com drogas em matrizes de colágeno, e para avaliar a mobilidade eficiente e os eventos de fagocitose subsequentes³⁵; iv) migração quimiotática de eosinófilos derivados da medula óssea para células de melanoma tratadas ou não tratadas com IL-33³⁶.

Esses modelos avançados poderiam servir como janelas de observação para a compreensão do papel do contexto imunológico na metástase do câncer e nos mecanismos de resistência, mas esforços são necessários para traduzir os achados para a clínica, fechando a lacuna com a pesquisa básica³⁷.

Como um cenário emergente, aproveitar o poder da microscopia automatizada de alto conteúdo acoplada ao uso de microssistemas fisiologicamente mais relevantes está abrindo novos desafios potenciais para o manuseio, processamento e interpretação de centenas, e até milhares, de Gigabytes de dados multiparamétricos, que podem ser gerados a partir de uma única campanha experimental. Isso implica uma ligação direta de experimentos de OOC com algoritmos baseados em inteligência artificial 38,39,40,41,42 (IA), tanto para análise automatizada avançada, quanto para geração de recursos que podem alimentar, por sua vez, modelos in silico de interação câncer-imune 43, com novas aplicações empolgantes no horizonte^, como o desenvolvimento de ensaios preditivos de triagem de drogas ⁴⁴.

Um fluxo de esforços em constante expansão está focado no design de modelos de doenças em conjunto com a otimização de estratégias para implementar as telas de perturbação em grande escala com leituras multi-ômicas de célula única. Isso sem dúvida ajudará o desenvolvimento e, esperançosamente, a implementação clínica, acompanhada por um grau apropriado de padronização do método, de uma abordagem onco-imunologia-on-a-chip sistemática para obter novos insights sobre distúrbios imunológicos e mecanismos de disseminação do câncer.