Modelos de cocultivo microfluídico para diseccionar la respuesta inmune en microambientes tumorales in vitro

La evolución de las diferentes ramas de la medicina como disciplinas experimentales ha dependido de la capacidad de manipular la población celular y las funciones orgánicas en condiciones controladas¹. Tal capacidad tiene sus raíces en la disponibilidad de modelos medibles capaces de recapitular los procesos que ocurren en nuestro cuerpo.

En la era de la inmunoterapia y el perfil genómico unicelular 2, la biología del cáncer necesita aprovechar los modelos emergentes in vitro y computacionales para investigar la interfaz tumor-inmune en un contexto espaciotemporal adecuado ^2,3.

El microambiente tumoral⁴ (TME) es un tejido complejo donde las células cancerosas interactúan continuamente y coevolucionan dinámicamente con los otros componentes celulares (células inmunes, estromales y endoteliales) y no celulares (la matriz extracelular, ECM). La naturaleza dinámica de este complejo paisaje dicta si las células inmunes juegan como amigas o enemigas de las células malignas, lo que afecta fuertemente tanto la progresión de la enfermedad como la respuesta a la terapia. Hoy en día, grandes esfuerzos de oncoinmunólogos, bioinformáticos y expertos en biología de sistemas están convergiendo para abordar la importancia clínica de la heterogeneidad del cáncer 5,6, ya sea en el espacio (es decir, en distintas regiones tumorales) y el tiempo (es decir, en distintas etapas de progresión tumoral)^5,6, y para caracterizar el fenotipo y la función del cáncer y las células inmunes a nivel de una sola célula. Como ejemplo de esta sinergia, las técnicas avanzadas de visión artificial se utilizan ahora de forma rutinaria para el mapeo espacial del infiltrado inmune en muestras histológicas ^7,8.

En el frente de los modelos experimentales, uniendo estudios en animales y métodos tradicionales in vitro, los avances en microfluídica y técnicas de cocultivo dan acceso a diferentes clases de modelos celulares de microingeniería como organoides, sistemas microfisiológicos 9,10,11 (MPS) y órganos en chip^12,13,14 (OOC). Comparten el rasgo común de ampliar la visión general de los ecosistemas celulares y expandir el potencial in vitro para controlar los factores microambientales mientras explotan la microscopía de alto contenido¹⁵ y los enfoques de procesamiento de imágenes.

Hoy en día, los sistemas MPS y OOC de última generación han comenzado a incluir aspectos inmunológicos, incorporando diferentes subtipos de células inmunes en tejidos y cocultivos existentes, para explorar y medir una variedad de procesos como enfermedades inflamatorias, cicatrización de heridas, inmunidad mucosa y respuesta a toxinas o productos alimenticios diarios¹⁶. Los modelos TME-on-a-chip 10,11,12,13,14,15,16,17, también integrados con microvasos perfusibles 18,19,20,21, se han desarrollado para investigar las interacciones dependientes del tipo celular, las perturbaciones físicas y químicas y la actividad citotóxica de linfocitos infiltrantes²², así como agentes inmunomoduladores clínicamente relevantes²³.

Aquí, proporcionamos protocolos versátiles, que abarcan desde células de carga en chips hasta herramientas de procesamiento de imágenes, para explotar cocultivos microfluídicos avanzados inmunes al tumor en configuraciones 2D (sección 1) y 3D (sección 2)¹⁶, compatibles con el monitoreo dinámico y multiparamétrico²⁴ y la visualización de funciones celulares. Esto se logra manteniendo la facilidad de uso y flexibilidad tanto en la gestión de muestras como en el análisis de datos, aprovechando el software gratuito de Fiji y sus cajas de herramientas^25,26.

El dispositivo microfluídico, descrito en la sección 1, está diseñado para realizar cocultivos 2D de cáncer adherente y células inmunes flotantes. Esta plataforma fue validada para la medición in vitro del comportamiento de las células inmunes en presencia de mutaciones genéticas²⁷ y/o inmunodeficiencias²⁸. Aquí, ilustramos los pasos para rastrear las células inmunes en imágenes de campo claro de lapso de tiempo, explotando un método semiautomático basado en Trackmate (un complemento implementado en el software de Fiji). Este procedimiento permite la extracción de descriptores cinemáticos de migración inmune ²⁹ y respuesta (es decir, tiempos de interacción) a células cancerosas diana, tratadas o no con inductores de muerte celular inmunogénica²⁷.

Es importante destacar que estos parámetros, extraídos de imágenes de series temporales, se pueden procesar con maquinaria matemática avanzada. Como ejemplo de la potencialidad de este enfoque, nuestros grupos publicaron recientemente un análisis basado en métodos matemáticos de procesos estocásticos y mecánica estadística para modelar las propiedades de la red celular y proporcionar una descripción parametrizada del comportamiento de las células inmunes (es decir, caminata aleatoria sesgada o no correlacionada, movimiento altamente o no coordinado^30,31).

La configuración 3D, proporcionada en la segunda sección, se basa en un protocolo de cocultivo para recrear TME inmunocompetentes más complejos incrustados en dos regiones de gel con diferentes combinaciones de tipos de células y medicamentos de manera competitiva. Aquí, se describen los pasos de procesamiento de imágenes para medir, en diferentes puntos temporales, la infiltración de células inmunes teñidas en células de melanoma A375M humano cultivadas dentro de Matrigel, para evaluar combinaciones de agentes antitumorales³². La línea A375M, una línea celular derivada de A375P caracterizada por un fenotipo altamente metastásico, fue elegida para evaluar su capacidad metastásica en presencia de células inmunes³².

Los modelos descritos pueden ser totalmente compatibles con diferentes fuentes celulares (líneas celulares murinas y humanas inmortalizadas o primarias, organoides, xenoinjertos, entre otros). En estudios recientes de nuestro laboratorio, al combinar microscopía de video de alto contenido con análisis de imágenes, se aplicó el diseño 3D competitivo para investigar: i) una respuesta inmune antitumoral (citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC) y diseccionar el papel de los fibroblastos en la resistencia a la terapia con trastuzumab en modelos en chip de cáncer de mama HER2^{+ 33}; ii) la acción de las células mieloides (es decir, macrófagos asociados al cáncer) en los mecanismos de evasión tumoral y reclutamiento de células T³⁴; iii) la eficacia de los regímenes inmunoterapéuticos, específicamente basados en células dendríticas condicionadas por interferón α (IFN-DC), cultivadas con células de cáncer de colon tratadas con fármacos en matrices de colágeno, y evaluar el movimiento eficiente y los eventos de fagocitosis subsiguientes³⁵; iv) la migración quimiotáctica de eosinófilos derivados de la médula ósea hacia células de melanoma tratadas o no tratadas con IL-33³⁶.

Estos modelos avanzados podrían servir como ventanas de observación para comprender el papel de la textura inmune en la metástasis del cáncer y los mecanismos de resistencia, pero se requieren esfuerzos para traducir los hallazgos a las clínicas, cerrando la brecha con la investigación básica³⁷.

Como escenario emergente, aprovechar el poder de la microscopía automatizada de alto contenido junto con el uso de microsistemas más relevantes fisiológicamente está abriendo nuevos desafíos potenciales para el manejo, procesamiento e interpretación de cientos, e incluso miles, de Gigabytes de datos multiparamétricos, que se pueden generar a partir de una sola campaña experimental. Esto implica un vínculo directo de los experimentos OOC con algoritmos basados en inteligencia artificial 38,39,40,41,42 (AI) tanto para el análisis automatizado avanzado como para la generación de características que pueden alimentar a su vez modelos in silico de interacción cáncer-inmune 43, con nuevas aplicaciones emocionantes en el horizonte^, como el desarrollo de ensayos predictivos de detección de medicamentos ⁴⁴.

Un flujo de esfuerzos cada vez mayor se centra en el diseño de modelos de enfermedades junto con la optimización de estrategias para implementar las pantallas de perturbación a gran escala con lecturas multiómicas de una sola célula. Sin duda, esto ayudará al desarrollo y, con suerte, a la implementación clínica, acompañada de un grado apropiado de estandarización del método, de un enfoque sistemático de oncoinmunología en un chip para obtener nuevos conocimientos sobre los trastornos inmunes y los mecanismos de diseminación del cáncer.