Микрофлюидные модели совместной культуры для анализа иммунного ответа в микроокружениях опухолей in vitro

Эволюция различных отраслей медицины как экспериментальных дисциплин зависела от способности манипулировать клеточной популяцией и функциями органов в контролируемых условиях¹. Такая способность уходит своими корнями в наличие измеримых моделей, способных повторять процессы, происходящие в нашем организме.

В эпоху иммунотерапии и одноклеточного геномного профилирования 2 биология рака должна использовать преимущества новых in vitro и вычислительных моделей для исследования интерфейса опухоль-иммунитет в надлежащем пространственно-временном контексте ^2,3.

Микроокружение^{опухоли 4} (TME) представляет собой сложную ткань, в которой раковые клетки непрерывно взаимодействуют и динамически развиваются вместе с другими клеточными (иммунные, стромальные и эндотелиальные клетки) и неклеточными (внеклеточный матрикс, ECM) компонентами. Динамическая природа этого сложного ландшафта определяет, играют ли иммунные клетки роль друзей или врагов злокачественных клеток, тем самым сильно влияя как на прогрессирование заболевания, так и на реакцию на терапию. В настоящее время онкоиммунологи, биоинформатики и эксперты в области системной биологии прилагают большие усилия для изучения клинической значимости гетерогенности рака 5,6 либо в пространстве (т.е. в отдельных опухолевых областях), либо во времени (т.е. на разных стадиях прогрессирования опухоли)^5,6, а также для характеристики фенотипа и функции рака и иммунных клеток на уровне отдельных клеток. В качестве примера этой синергии в настоящее время регулярно используются передовые методы компьютерного зрения для пространственного картирования иммунного инфильтрата в гистологических образцах ^7,8.

Что касается экспериментальных моделей, то исследования на животных и традиционные методы in vitro, достижения в области микрофлюидики и методов совместного культивирования дают доступ к различным классам микроинженерных клеточных моделей, таких как органоиды, микрофизиологические системы 9,10,11 (MPS) и органы на чипе^12,13,14 (ООК). У них есть общая черта, заключающаяся в том, чтобы увеличивать «общую картину» клеточных экосистем и расширять потенциал in vitro для контроля факторов микросреды, используя при этом микроскопию с высоким содержанием¹⁵ и подходы к обработке изображений.

В настоящее время современные системы МПС и ООК начали включать иммунологические аспекты, включая различные подтипы иммунных клеток в существующие ткани и кокультуры, чтобы исследовать и измерять различные процессы, такие как воспалительные заболевания, заживление ран, иммунитет слизистой оболочки и реакция на токсины или повседневные пищевые продукты¹⁶. Модели TME-on-a-chip 10,11,12,13,14,15,16,17, также интегрированные с перфузируемыми микрососудами 18,19,20,21, были разработаны для исследования клеточно-тип-зависимых взаимодействий, физических и химических возмущений и цитотоксической активности инфильтрирующие лимфоциты²², а также клинически значимые иммуномодулирующие средства²³.

Здесь мы предлагаем универсальные протоколы, начиная от загрузочных клеток в чипах и заканчивая инструментами обработки изображений, для использования передовых иммуноферментных микрофлюидных кокультур в 2D (раздел 1) и 3D (раздел 2)¹⁶, совместимых с динамическим, многопараметрическим²⁴ мониторингом и визуализацией клеточных функций. Это достигается за счет сохранения простоты использования и гибкости как в управлении выборками, так и в анализе данных, используя преимущества бесплатного программного обеспечения Фиджи и его наборов инструментов^25,26.

Микрофлюидное устройство, описанное в разделе 1, предназначено для проведения 2D-кокультур адгезивных раковых и плавающих иммунных клеток. Эта платформа была валидирована для измерения in vitro поведения иммунных клеток при наличии генетических мутаций²⁷ и/или иммунодефицитов²⁸. Здесь мы проиллюстрируем шаги по отслеживанию иммунных клеток в покадровых изображениях яркого поля, используя полуавтоматический метод, основанный на Trackmate (плагин, реализованный в программном обеспечении Фиджи). Эта процедура позволяет извлекать кинематические дескрипторы иммунной миграции ²⁹ и ответа (т.е. времени взаимодействия) на раковые клетки-мишени, обработанные или не обработанные иммуногенными индукторами²⁷ гибели клеток.

Важно отметить, что эти параметры, извлеченные из изображений временных рядов, могут быть обработаны с помощью передового математического оборудования. В качестве примера потенциальности этого подхода наши группы недавно опубликовали анализ, основанный на математических методах стохастических процессов и статистической механики, для моделирования свойств клеточной сети и предоставления параметризованного описания поведения иммунных клеток (т.е. смещенного или некоррелированного случайного блуждания, высоко или нескоординированного движения^30,31).

Настройка 3D, представленная во втором разделе, основана на протоколе совместного культивирования для воссоздания более сложных иммунокомпетентных TME, встроенных в две области геля с различными комбинациями типов клеток и лекарств в конкурентной манере. Здесь описаны этапы обработки изображений для измерения в различные моменты времени инфильтрации окрашенных иммунных клеток в клетки меланомы человека A375M, культивируемые в Matrigel, для оценки комбинаций противоопухолевых агентов³². Линия A375M, клеточная линия, полученная из A375P, характеризующаяся высокометастатическим фенотипом, была выбрана для оценки их метастатической способности в присутствии иммунных клеток³².

Описанные модели могут быть полностью совместимы с различными клеточными источниками (мышиные и человеческие иммортализированные или первичные клеточные линии, органоиды, ксенотрансплантаты и другие). В недавних исследованиях нашей лаборатории, сочетая видеомикроскопию с высоким содержанием с анализом изображений, конкурентный 3D-макет был применен для изучения: i) противоопухолевого (антителозависимой клеточно-опосредованной цитотоксичности, ADCC) иммунного ответа и анализа роли фибробластов в резистентности к терапии трастузумабом в моделях рака молочной железы HER2⁺ на чипе³³; ii) действие миелоидных клеток (т.е. рак-ассоциированных макрофагов) в механизмах уклонения от опухоли и рекрутирования Т-клеток³⁴; iii) эффективность иммунотерапевтических режимов, в частности, основанных на дендритных клетках, кондиционированных интерфероном α (ИФН-ДК), культивируемых с помощью обработанных лекарственными препаратами клеток рака толстой кишки в коллагеновых матрицах, а также для оценки эффективного движения и последующих событий фагоцитоза³⁵; iv) хемотаксическая миграция эозинофилов, полученных из костного мозга, к клеткам меланомы, обработанным или необработанным^{IL-33 36}.

Эти передовые модели могут служить окнами наблюдения для понимания роли иммунной структуры в метастазировании рака и механизмах резистентности, но требуются усилия для перевода результатов в клиники, закрывая пробел с фундаментальными исследованиями³⁷.

В качестве нового сценария использование возможностей автоматизированной микроскопии с высоким содержанием в сочетании с использованием более физиологически значимых микросистем открывает новые потенциальные проблемы для обработки, обработки и интерпретации сотен и даже тысяч гигабайт многопараметрических данных, которые могут быть получены в результате одной экспериментальной кампании. Это подразумевает прямую связь экспериментов OOC с алгоритмами на основе искусственного интеллекта 38,39,40,41,42 (ИИ) как для расширенного автоматизированного анализа, так и для генерации функций, которые, в свою очередь, могут питать in silico модели взаимодействия рака и иммунитета⁴³, с захватывающими новыми приложениями^на горизонте^, такими как разработка прогностических скрининговых анализов^{лекарств 44}.

Постоянно расширяющийся поток усилий сосредоточен на разработке моделей заболеваний вместе с оптимизацией стратегий реализации крупномасштабных экранов возмущений с одноклеточными мультиомиксными показаниями. Это, несомненно, поможет разработке и, надеюсь, клиническому внедрению, сопровождаемому соответствующей степенью стандартизации метода, систематического подхода онкоиммунологии на чипе, чтобы получить новое представление об иммунных нарушениях и механизмах распространения рака.