Mor-Heyecanlı Hücre-Geçirgen DNA Bağlayıcı Boya Kullanılarak Murine Spermatojenik Hücrelerin İzolasyon
Summary
Burada yetişkin fare testislerinden canlı meiotik ve post-meyotik mikrop hücrelerini izole etmek için basit ve etkili bir yöntem salıyoruz. Düşük sitotoksisite, menekşe heyecanlı DNA bağlayıcı boya ve floresan-aktive hücre sıralama kullanarak, bir birçok downstream uygulamaları için son derece zenginleştirilmiş spermatojenik hücre popülasyonları izole edebilirsiniz.
Abstract
Meyozis ve spermatogenezin altında yatan moleküler mekanizmaları araştırmak için meyotik spermatositlerin izolasyonu esastır. Floresan aktive hücre sıralama ile birlikte Hoechst 33342 boyama kullanarak kurulmuş hücre izolasyon protokolleri olmasına rağmen, ultraviyole lazer ile donatılmış hücre ayırıcılar gerektirir. Burada, Hoechst 33342’ye benzer yapısal olarak benzeyen düşük sitotoksisite DNA bağlayıcıboyası Olan DyeCycle Violet (DCV) lekesi kullanılarak bir hücre izolasyon protokolü tanımlanmaktadır. DCV hem ultraviyole hem de mor lazerler tarafından heyecanlı olabilir, hangi ekipman seçimi esnekliğini artırır, ultraviyole lazer ile donatılmış olmayan bir hücre ayırıcı dahil. Bu protokolü kullanarak, leptoten/zigotene, pachytene ve diplotene spermatositler de dahil olmak üzere meyotik profaz I’de üç canlı hücre alt popülasyonunu ve post-meiyotik yuvarlak spermatidleri izole edebilir. Ayrıca fare testislerinden tek hücreli süspansiyon hazırlamak için bir protokol açıklarız. Genel olarak, yordamın tamamlanması için kısa bir süre (gerekli hücrelerin sayısına bağlı olarak 4-5 saat), birçok downstream uygulamaları kolaylaştırır gerektirir.
Introduction
Spermatogenez spermatogonial kök hücrelerin küçük bir popülasyon yetişkinyaşam1,2boyunca sperm çok sayıda sürekli üretimini sürdürmek karmaşık bir süreçtir. Spermatogenez sırasında, dinamik kromatin remodeling spermatojenik hücreler haploid spermatidsüretmekiçin meyozis geçmesi gerçekleşir 3,4,5. Meyotik spermatositlerin izolasyonu moleküler araştırma için gereklidir ve sedimantasyona dayalı ayırma6,7 ve floresanaktif hücre ayrıştırma (FACS)8,9,10,11,12,13,14,15,16,17dahil olmak üzere meyotik spermatositleri izole etmek için çeşitli yaklaşımlar oluşturulmuştur. Ancak, bu yöntemlerin teknik sınırlamaları vardır. Sedimantasyon aparatlığı çok sayıda hücre yitirmede5,6,7, emek yoğundur. Kurulan FACS tabanlı yöntem DNA içeriği ve ışık saçılma özelliklerine göre meiotik spermatositleri ayırmak için Hoechst 33342 (Ho342) kullanır ve bir ultraviyole (UV) lazer8,9,10,11ile donatılmış FACS hücre ayırıcıları gerektirir. Alternatif FACS tabanlı yöntemler floresan proteinleri ifade transgenik fare hatları gerektirir, spermatogenez senkronizasyonu12, veya hücre fiksasyonu ve canlı hücrelerin izolasyonu ile uyumlu olmayan antikor etiketleme13. Hücre geçirgen DNA bağlayıcı boya, BoyaDöngüsüYeşil leke14, 15,16,17kullanarak başka bir alternatif yöntem olsa da, bu yöntem juvenil testislerden spermatojenik hücrelerin izolasyonu için tavsiye edilir. Bu nedenle, herhangi bir yaştaki herhangi bir fare suş uygulanabilir ve herhangi bir FACS hücre ayırıcı kullanılarak yapılabilir canlı meiotik spermatositler için basit ve sağlam bir izolasyon yöntemi geliştirmek için kritik bir ihtiyaç vardır.
Burada Boya Döngüsü Menekşe (DCV) lekekullanarak böyle uzun zamandır aranan hücre izolasyon protokolü açıklar. DCV düşük sitotoksisite, hücre geçirilebilir DNA bağlayıcı boya yapısal Ho342 benzer ama bir uyarma spektrumu ile menekşe aralığı doğru kaymıştır18. Buna ek olarak, DCV DCG ile karşılaştırıldığında daha geniş bir emisyon spektrumuna sahiptir. Böylece, uv lazer ile donatılmış olmayan bir FACS hücre ayırıcı kullanımına izin, ekipman esnekliğini artırır hem UV ve menekşe lazerler, tarafından heyecan verici olabilir. Burada sunulan DCV protokolü, Ho342 protokolünün avantajını taklit eden, DCV mavi ve DCV kırmızı ile iki boyutlu ayırma kullanır. Bu avantajla, DCV protokolümüz yetişkin testislerinden yüksek oranda zenginleştirilmiş mikrop hücrelerini izole etmemizi sağlar. Canlı spermatojenik hücreleri bir farenin yetişkin fare testislerinden (iki testisten) izole etmek için ayrıntılı bir gating protokolü salıyoruz. Ayrıca, bu hücre yalıtımı için kullanılabilecek fare testislerinden tek hücreli süspansiyon hazırlamak için etkili ve hızlı bir protokol açıklarız. Prosedürütamamlamak için kısa bir süre gerektirir (tek hücreli süspansiyon hazırlanması – 1 saat, boya boyama – 30 dk ve hücre sıralama – 2-3 saat: toplam – 4-5 saat gerekli hücrelerin sayısına bağlı olarak; Şekil 1). Hücre izolasyonu sonrasında, RNA-seq, ATAC-seq, ChIP-seq ve hücre kültürü gibi çok çeşitli downstream uygulamaları tamamlanabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada spermatosit ve spermatid alt popülasyonlarını tek bir yetişkin erkek fareden izole etmek için pratik ve basit bir protokol salıyoruz. Bu protokolün tekrarlanabilirliğini sağlamak için dikkat gerektiren bazı kritik adımlar vardır. Enzim sindiriminden önce, yıkama adımı interstisyel hücreleri ortadan kaldırmayı amaçlar; sindirim sonra, bu adım spermatozoa ve enkaz kaldırmak için yardımcı olur. Yıkama / santrifüj 3 kez önemlidir. Bizim dissosyasyon tampon tarifi, birkaç farklı enzimleri…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz Yardımları için Namekawa, Yoshida ve Maezawa laboratuvarları üyelerine teşekkür ederiz; Katie Gerhardt el yazması düzenleme için; Mary Ann Handel H1T antikor paylaşımı için, Cincinnati Çocuk Hastanesi Tıp Merkezi (CCHMC) Araştırma Akış Sitometri Core NIH S10OD023410 tarafından desteklenen FACS ekipman paylaşımı için; T.N.’ye Bilimsel Araştırma Yardımı (KAKENHI; 17K07424); Lalor Vakfı Doktora Sonrası Bursu A.Ş.’ye; AMED-CREST (JP17gm1110005h0001) için S.Y.; Azabu Üniversitesi Araştırma Hizmetleri Bölümü, Milli Eğitim Bakanlığı, Kültür, Spor, Bilim ve Teknoloji Bakanlığı (MEXT)-Özel Üniversite Araştırma Markalaşma Projesi Destekli Programı (2016-2019), Araştırma Faaliyeti Başlatma Hibesi (19K21196), Takeda Bilim Vakfı (2019) ve Uehara Memorial Vakfı Araştırma Teşviki (2018) tarafından S.M’ ye; Ulusal Sağlık Enstitüsü R01 GM122776 Için S.H.N.
Materials
| 1.5 ml tube | Watson | 131-7155C | |
| 100 mm Petri dish | Corning, Falcon | 351029 | |
| 15 mL Centrifuge tube | Watson | 1332-015S | |
| 5 ml polystyrene tube with cell strainer snap cap (35 µm nylon mesh) | Corning, Falcon | 352235 | |
| 50 mL Centrifuge tube | Watson | 1342-050S | |
| 60 mm Petri dish | Corning, Falcon | 351007 | |
| 70 µm nylon mesh | Corning, Falcon | 352350 | |
| Cell sorter | Sony | SH800S | |
| Centrifuge | |||
| Collagenase, recombinant, Animal-derived-free | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 036-23141 | |
| Collagenase, Type 1 | Worthington | LS004196 | |
| Cover glass | Fisher | 12-544-G | |
| Cytospin 3 | Shandon | ||
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Fisher | D1306 | working concentration: 0.1 μg/mL |
| Dnase I | Sigma | D5025-150KU | |
| Donkey serum | Sigma | S30-M | |
| Dulbecco’s phosphate-buffered saline (DPBS) | Gibco | 14190144 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 11885076 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 16000044 | |
| Hostone H1T antibody | gift from Mary Ann Handel | 1/2000 diluted | |
| Hank’s balanced salt solution (HBSS) | Gibco | 14175095 | |
| Hyaluronidase from bovine testes | Sigma | H3506-1G | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma | P5493-4L | |
| Pipettemen | |||
| ProLong Gold Antifade Mountant | Fisher | P36930 | |
| rH2AX antibody | Millipore | 05-635 | working concentration: 2 μg/mL |
| Sperm Fertilization Protein 56 (Sp56) antibody | QED Bioscience | 55101 | working concentration: 0.5 μg/mL |
| Sterilized forceps and scissors | |||
| Superfrost /Plus Microscope Slides | Fisher | 12-550-15 | |
| SYCP3 antibody | Abcam | ab205846 | working concentration: 5 μg/mL |
| TWEEN 20 (Polysorbate 20) | Sigma | P9416 | |
| Vybrant DyeCycle Violet Stain (DCV) | Invitrogen | V35003 | |
| Water bath |
References
- Griswold, M. D. Spermatogenesis: The Commitment to Meiosis. Physiological Reviews. 96 (1), 1-17 (2016).
- Yoshida, S. Mouse Spermatogenesis Reflects the Unity and Diversity of Tissue Stem Cell Niche Systems. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. , 036186 (2020).
- Rathke, C., Baarends, W. M., Awe, S., Renkawitz-Pohl, R. Chromatin dynamics during spermiogenesis. Biochimica et Biophysica Acta. 1839 (3), 155-168 (2014).
- Maezawa, S., et al. SCML2 promotes heterochromatin organization in late spermatogenesis. Journal of Cell Science. 131 (17), 217125 (2018).
- Maezawa, S., Yukawa, M., Alavattam, K. G., Barski, A., Namekawa, S. H. Dynamic reorganization of open chromatin underlies diverse transcriptomes during spermatogenesis. Nucleic Acids Research. 46 (2), 593-608 (2018).
- Bellve, A. R. Purification, culture, and fractionation of spermatogenic cells. Methods in Enzymology. 225, 84-113 (1993).
- Bryant, J. M., Meyer-Ficca, M. L., Dang, V. M., Berger, S. L., Meyer, R. G. Separation of spermatogenic cell types using STA-PUT velocity sedimentation. Journal of Visualized Experiments. (80), e50648 (2013).
- Gaysinskaya, V., Bortvin, A. Flow cytometry of murine spermatocytes. Current Protocols in Cytometry. 72, (2015).
- Bastos, H., et al. Flow cytometric characterization of viable meiotic and postmeiotic cells by Hoechst 33342 in mouse spermatogenesis. Cytometry Part A. 65 (1), 40-49 (2005).
- Getun, I. V., Torres, B., Bois, P. R. Flow cytometry purification of mouse meiotic cells. Journal of Visualized Experimments. (50), e2602 (2011).
- Gaysinskaya, V., Soh, I. Y., van der Heijden, G. W., Bortvin, A. Optimized flow cytometry isolation of murine spermatocytes. Cytometry Part A. 85 (6), 556-565 (2014).
- Romer, K. A., de Rooiji, D. G., Kojima, M. L., Page, D. C. Isolating mitotic and meiotic germ cells from male mice by developmental synchronization, staging, and sorting. Developmental Biology. 443 (1), 19-34 (2018).
- Lam, K. G., Brick, K., Cheng, G., Pratto, F., Camerini-Otero, R. D. Cell-type-specific genomics reveals histone modification dynamics in mammalian meiosis. Nature Communications. 10 (1), 3821 (2019).
- Geisinger, A., Rodriguez-Casuriaga, R. Flow Cytometry for the Isolation and Characterization of Rodent Meiocytes. Methods in Molecular Biology. 1471, 217-230 (2017).
- da Cruz, I., et al. Transcriptome analysis of highly purified mouse spermatogenic cell populations: gene expression signatures switch from meiotic-to postmeiotic-related processes at pachytene stage. BMC Genomics. 17, 294 (2016).
- Rodriguez-Casuriaga, R., et al. Rapid preparation of rodent testicular cell suspensions and spermatogenic stages purification by flow cytometry using a novel blue-laser-excitable vital dye. MethodsX. 1, 239-243 (2014).
- Trovero, M. F., et al. Revealing stage-specific expression patterns of long noncoding RNAs along mouse spermatogenesis. RNA Biology. 17 (3), 350-365 (2020).
- Telford, W. G., Bradford, J., Godfrey, W., Robey, R. W., Bates, S. E. Side population analysis using a violet-excited cell-permeable DNA binding dye. Stem Cells. 25 (4), 1029-1036 (2007).
- Alavattam, K. G., Abe, H., Sakashita, A., Namekawa, S. H. Chromosome Spread Analyses of Meiotic Sex Chromosome Inactivation. Methods in Molecular Biology. 1861, 113-129 (2018).
- Maezawa, S., et al. Super-enhancer switching drives a burst in gene expression at the mitosis-to-meiosis transition. Nature Structural & Molecular Biology. , (2020).
- Sakashita, A., et al. Endogenous retroviruses drive species-specific germline transcriptomes in mammals. Nature Structural & Molecular Biology. , (2020).
- Agrimson, K. S., et al. Characterizing the Spermatogonial Response to Retinoic Acid During the Onset of Spermatogenesis and Following Synchronization in the Neonatal Mouse Testis. Biology of Reproduction. 95 (4), 81 (2016).
- Hogarth, C. A., et al. Turning a spermatogenic wave into a tsunami: synchronizing murine spermatogenesis using WIN 18,446. Biology of Reproduction. 88 (2), 40 (2013).
- Patel, L., et al. Dynamic reorganization of the genome shapes the recombination landscape in meiotic prophase. Nature Structural & Molecular Biology. 26 (3), 164-174 (2019).
- Alavattam, K. G., et al. Attenuated chromatin compartmentalization in meiosis and its maturation in sperm development. Nature Structural & Molecular Biology. 26 (3), 175-184 (2019).
- Adams, S. R., et al. RNF8 and SCML2 cooperate to regulate ubiquitination and H3K27 acetylation for escape gene activation on the sex chromosomes. PLoS Genetics. 14 (2), 1007233 (2018).
- Wiltshire, T., Park, C., Caldwell, K. A., Handel, M. A. Induced premature G2/M-phase transition in pachytene spermatocytes includes events unique to meiosis. Developmental Biology. 169 (2), 557-567 (1995).
