バイオレット励起細胞透過性DNA結合色素を用いたマウス精子細胞の分離

精子形成は、精子幹細胞の小集団が^成人期を通じて多数の精子の連続的産生を^1,2に持続する複雑なプロセスである。精子形成の間に、動的クロマチンリモデリングは、精子原性細胞が子宮内膜を産生するために^、3、4、5を産生するために、ミオサシスを受けたときに起こる。メオティック精子細胞の単離は分子学的調査に不可欠であり、沈め込みベースの分離^6、7、蛍光活性化細胞選別(FACS)8、9、10、11、12、13、14、15、16、17を含む、複数の異なるアプローチが確立されている。ただし、これらの方法には技術的な制限があります。沈下法による分離は^{、5、6、7の細胞を}多数生成する一方で、労働集約的である。確立されたFACSベースの方法は、DNA含有量および光散乱特性に基づいて微量精子細胞を分離するためにHoechst 33342(Ho342)を使用し、紫外線(UV)レーザー^{8、9、10、11}を備えたFACS細胞選別機を必要とする。代替FACSベースの方法は、蛍光タンパク質を発現するトランスジェニックマウスライン、精子形成¹²の同期、または生細胞¹³の単離と互換性のない細胞固定および抗体標識を必要とする。細胞透過性DNA結合色素を用いた別の方法があるが、DyeCycleグリーン染色^{14、15、16、17}のこの方法は、若年精巣から精子細胞を単離するために推奨される。したがって、任意の年齢の任意のマウス株に適用することができ、任意のFACS細胞選別機を使用して実行することができる生きている病変精子細胞のための単純で堅牢な分離方法を開発することが重要な必要性があります。

ここでは、DyeCycleバイオレット(DCV)染色を用いた、このような長い間求められていた細胞分離プロトコルについて説明する。DCVは、低細胞毒性、細胞透過性DNA結合色素はHo342に構造的に類似しているが、励起スペクトルが紫範囲¹⁸に向かってシフトしている。さらに、DCVはDCGに比べて広い発光スペクトルを有する。したがって、UVと紫の両方のレーザーで励起することができ、それは、UVレーザーを装備していないFACSセルソーターの使用を可能にする、機器の柔軟性を向上させます。ここで示すDCVプロトコルは、DCVブルーとDCVレッドとの2次元分離を使用し、Ho342プロトコルの利点を模倣しています。この利点により、当社のDCVプロトコルは、成人精巣から高度に濃縮された生殖細胞を分離することを可能にします。我々は、1匹のマウスの成体マウス精巣(2つの精巣から)から生きた精子細胞を分離するための詳細な格言プロトコルを提供する。また、この細胞分離に使用できるマウスのテストからの単一細胞の中断を準備するための効率的かつ迅速なプロトコルについても説明します。手順は、完了する短い時間を必要とします (単一細胞の懸濁液の調製 – 1時間、染料染色 – 30分、および細胞のソート – 2-3時間:合計 – 必要な細胞の数に応じて4〜5時間; 図 1)。細胞分離後、RNA-セク、ATAC-セク、ChIP-セク、および細胞培養を含む広範な下流アプリケーションを完了することができます。