Summary

バイオレット励起細胞透過性DNA結合色素を用いたマウス精子細胞の分離

Published: January 14, 2021
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Summary

ここでは、成人マウス精巣から生の大腸および後の大動脈芽細胞を分離する簡単で効率的な方法を提示する。低細胞毒性、バイオレット励起DNA結合色素および蛍光活性化細胞選別を使用して、多くの下流用途に対して非常に富んだ精子細胞集団を単離することができる。

Abstract

メオティック精子細胞の単離は、疾患の根底にある分子メカニズムと精子形成を調べる上で不可欠である。蛍光活性化細胞選別と組み合わせてHoechst 33342染色を使用して確立された細胞分離プロトコルがありますが、紫外線レーザーを装備した細胞選別機が必要です。ここでは、ヘヒスト33342と構造的に類似した低細胞毒性DNA結合色素であるDyeCycle Violet(DCV)染色を用いた細胞分離プロトコルについて説明する。DCVは紫外線レーザーと紫レーザーの両方で励起することができ、紫外線レーザーを搭載していないセルソーターを含む機器の選択の柔軟性を向上させます。このプロトコルを使用すると、レプトテン/ジゴテン、パキテン、ジプロテン精子細胞、およびポストマイオティックラウンド精子を含む、マイオティックプロフェイズIの3つの生細胞亜集団を分離することができます。また、マウスの精巣からの単細胞の中断を準備するプロトコルについても述べた。全体的に見て、この手順は、多くの下流のアプリケーションを容易にする(必要な細胞の数に応じて4〜5時間)完了するまでに短い時間を必要とします。

Introduction

精子形成は、精子幹細胞の小集団が成人期を通じて多数の精子の連続的産生を1,2に持続する複雑なプロセスである。精子形成の間に、動的クロマチンリモデリングは、精子原性細胞が子宮内膜を産生するために、3、4、5を産生するために、ミオサシスを受けたときに起こる。メオティック精子細胞の単離は分子学的調査に不可欠であり、沈め込みベースの分離6、7、蛍光活性化細胞選別(FACS)8、9、10、11、12、13、14、15、16、17を含む、複数の異なるアプローチが確立されている。ただし、これらの方法には技術的な制限があります。沈下法による分離は、5、6、7の細胞を多数生成する一方で、労働集約的である。確立されたFACSベースの方法は、DNA含有量および光散乱特性に基づいて微量精子細胞を分離するためにHoechst 33342(Ho342)を使用し、紫外線(UV)レーザー8、9、10、11を備えたFACS細胞選別機を必要とする。代替FACSベースの方法は、蛍光タンパク質を発現するトランスジェニックマウスライン、精子形成12の同期、または生細胞13の単離と互換性のない細胞固定および抗体標識を必要とする。細胞透過性DNA結合色素を用いた別の方法があるが、DyeCycleグリーン染色14、15、16、17のこの方法は、若年精巣から精子細胞を単離するために推奨される。したがって、任意の年齢の任意のマウス株に適用することができ、任意のFACS細胞選別機を使用して実行することができる生きている病変精子細胞のための単純で堅牢な分離方法を開発することが重要な必要性があります。

ここでは、DyeCycleバイオレット(DCV)染色を用いた、このような長い間求められていた細胞分離プロトコルについて説明する。DCVは、低細胞毒性、細胞透過性DNA結合色素はHo342に構造的に類似しているが、励起スペクトルが紫範囲18に向かってシフトしている。さらに、DCVはDCGに比べて広い発光スペクトルを有する。したがって、UVと紫の両方のレーザーで励起することができ、それは、UVレーザーを装備していないFACSセルソーターの使用を可能にする、機器の柔軟性を向上させます。ここで示すDCVプロトコルは、DCVブルーとDCVレッドとの2次元分離を使用し、Ho342プロトコルの利点を模倣しています。この利点により、当社のDCVプロトコルは、成人精巣から高度に濃縮された生殖細胞を分離することを可能にします。我々は、1匹のマウスの成体マウス精巣(2つの精巣から)から生きた精子細胞を分離するための詳細な格言プロトコルを提供する。また、この細胞分離に使用できるマウスのテストからの単一細胞の中断を準備するための効率的かつ迅速なプロトコルについても説明します。手順は、完了する短い時間を必要とします (単一細胞の懸濁液の調製 – 1時間、染料染色 – 30分、および細胞のソート – 2-3時間:合計 – 必要な細胞の数に応じて4〜5時間; 図 1)。細胞分離後、RNA-セク、ATAC-セク、ChIP-セク、および細胞培養を含む広範な下流アプリケーションを完了することができます。

Protocol

このプロトコルは、制度的動物の世話と使用委員会のガイドラインに従います(プロトコルいいえ。IACUC2018-0040)シンシナティ小児病院医療センターで。 精巣細胞懸濁液の調製のための装置および試薬のセットアップ 各酵素ストックを1xハンクスバランスソルト溶液(HBSS)で準備し、-20°C(表1)に保管する。注: 実験の前にいつでも準備してください。</li…

Representative Results

この分類プロトコルの代表的な結果を図 3に示します。2つの精巣(1つのマウス)の総選別時間は、通常、細胞懸濁液の濃度と並べ替え速度に依存する約3時間である。選別後、SYCP3およびγH2AXの免疫染色により精子細胞の純度が確認される(図3A)。並べ替えられたL/Z、P、D精子の分画の代表純度は、それぞれ約80.4%、90.6%、および87.6%である(<strong class="xfi…

Discussion

ここでは、単一の成人男性マウスから精子と精子の亜集団を分離するための実用的で簡単なプロトコルを提示する。このプロトコルの再現性を確保するために、注意が必要な重要な手順がいくつかあります。酵素消化の前に、洗浄ステップは間質細胞を除去することを目的としている。消化後、このステップは精子や破片を除去するのに役立ちます。洗浄/遠心分離3回が重要です。当社の解?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

名川、吉田、前沢の研究室のメンバーの皆さんに、ご協力いただき、ありがとうございました。原稿を編集するためのケイティ・ゲルハルト;H1T抗体を共有するためのメアリー・アン・ヘンデル、シンシナティ小児病院医療センター(CCHMC)研究フローサイトメトリーコアは、NIH S10OD023410がサポートするFACS機器を共有するための。科学研究のための助成(KAKENHI;17K07424)からT.N.へ。ラロール財団A.S.へのポスドクフェローシップ;アメド・クレスト(JP17gm1110005h00001)からS.Y.へ;麻布大学研究サービス部、文部科学省(MEXT)支援の私立大学研究ブランディング事業(2016~2019年)支援プログラム、研究活動立ち上げ助成(19K21196)、武田科学財団(2019年)、上原記念財団研究奨励助成(20.M 18)による研究プロジェクト助成金国立衛生研究所 R01 GM122776 to S.H.N.

Materials

1.5 ml tube Watson 131-7155C
100 mm Petri dish Corning, Falcon 351029
15 mL Centrifuge tube Watson 1332-015S
5 ml polystyrene tube with cell strainer snap cap (35 µm nylon mesh) Corning, Falcon 352235
50 mL Centrifuge tube Watson 1342-050S
60 mm Petri dish Corning, Falcon 351007
70 µm nylon mesh Corning, Falcon 352350
Cell sorter Sony SH800S
Centrifuge
Collagenase, recombinant, Animal-derived-free FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation 036-23141
Collagenase, Type 1 Worthington LS004196
Cover glass Fisher 12-544-G
Cytospin 3 Shandon
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) Fisher D1306 working concentration: 0.1 μg/mL
Dnase I Sigma D5025-150KU
Donkey serum Sigma S30-M
Dulbecco’s phosphate-buffered saline (DPBS) Gibco 14190144
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Gibco 11885076
Fetal bovine serum (FBS) Gibco 16000044
Hostone H1T antibody gift from Mary Ann Handel 1/2000 diluted
Hank’s balanced salt solution (HBSS) Gibco 14175095
Hyaluronidase from bovine testes Sigma H3506-1G
Phosphate buffered saline (PBS) Sigma P5493-4L
Pipettemen
ProLong Gold Antifade Mountant Fisher P36930
rH2AX antibody Millipore 05-635 working concentration: 2 μg/mL
Sperm Fertilization Protein 56 (Sp56) antibody QED Bioscience 55101 working concentration: 0.5 μg/mL
Sterilized forceps and scissors
Superfrost /Plus Microscope Slides Fisher 12-550-15
SYCP3 antibody Abcam ab205846 working concentration: 5 μg/mL
TWEEN 20 (Polysorbate 20) Sigma P9416
Vybrant DyeCycle Violet Stain (DCV) Invitrogen V35003
Water bath

References

  1. Griswold, M. D. Spermatogenesis: The Commitment to Meiosis. Physiological Reviews. 96 (1), 1-17 (2016).
  2. Yoshida, S. Mouse Spermatogenesis Reflects the Unity and Diversity of Tissue Stem Cell Niche Systems. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. , 036186 (2020).
  3. Rathke, C., Baarends, W. M., Awe, S., Renkawitz-Pohl, R. Chromatin dynamics during spermiogenesis. Biochimica et Biophysica Acta. 1839 (3), 155-168 (2014).
  4. Maezawa, S., et al. SCML2 promotes heterochromatin organization in late spermatogenesis. Journal of Cell Science. 131 (17), 217125 (2018).
  5. Maezawa, S., Yukawa, M., Alavattam, K. G., Barski, A., Namekawa, S. H. Dynamic reorganization of open chromatin underlies diverse transcriptomes during spermatogenesis. Nucleic Acids Research. 46 (2), 593-608 (2018).
  6. Bellve, A. R. Purification, culture, and fractionation of spermatogenic cells. Methods in Enzymology. 225, 84-113 (1993).
  7. Bryant, J. M., Meyer-Ficca, M. L., Dang, V. M., Berger, S. L., Meyer, R. G. Separation of spermatogenic cell types using STA-PUT velocity sedimentation. Journal of Visualized Experiments. (80), e50648 (2013).
  8. Gaysinskaya, V., Bortvin, A. Flow cytometry of murine spermatocytes. Current Protocols in Cytometry. 72, (2015).
  9. Bastos, H., et al. Flow cytometric characterization of viable meiotic and postmeiotic cells by Hoechst 33342 in mouse spermatogenesis. Cytometry Part A. 65 (1), 40-49 (2005).
  10. Getun, I. V., Torres, B., Bois, P. R. Flow cytometry purification of mouse meiotic cells. Journal of Visualized Experimments. (50), e2602 (2011).
  11. Gaysinskaya, V., Soh, I. Y., van der Heijden, G. W., Bortvin, A. Optimized flow cytometry isolation of murine spermatocytes. Cytometry Part A. 85 (6), 556-565 (2014).
  12. Romer, K. A., de Rooiji, D. G., Kojima, M. L., Page, D. C. Isolating mitotic and meiotic germ cells from male mice by developmental synchronization, staging, and sorting. Developmental Biology. 443 (1), 19-34 (2018).
  13. Lam, K. G., Brick, K., Cheng, G., Pratto, F., Camerini-Otero, R. D. Cell-type-specific genomics reveals histone modification dynamics in mammalian meiosis. Nature Communications. 10 (1), 3821 (2019).
  14. Geisinger, A., Rodriguez-Casuriaga, R. Flow Cytometry for the Isolation and Characterization of Rodent Meiocytes. Methods in Molecular Biology. 1471, 217-230 (2017).
  15. da Cruz, I., et al. Transcriptome analysis of highly purified mouse spermatogenic cell populations: gene expression signatures switch from meiotic-to postmeiotic-related processes at pachytene stage. BMC Genomics. 17, 294 (2016).
  16. Rodriguez-Casuriaga, R., et al. Rapid preparation of rodent testicular cell suspensions and spermatogenic stages purification by flow cytometry using a novel blue-laser-excitable vital dye. MethodsX. 1, 239-243 (2014).
  17. Trovero, M. F., et al. Revealing stage-specific expression patterns of long noncoding RNAs along mouse spermatogenesis. RNA Biology. 17 (3), 350-365 (2020).
  18. Telford, W. G., Bradford, J., Godfrey, W., Robey, R. W., Bates, S. E. Side population analysis using a violet-excited cell-permeable DNA binding dye. Stem Cells. 25 (4), 1029-1036 (2007).
  19. Alavattam, K. G., Abe, H., Sakashita, A., Namekawa, S. H. Chromosome Spread Analyses of Meiotic Sex Chromosome Inactivation. Methods in Molecular Biology. 1861, 113-129 (2018).
  20. Maezawa, S., et al. Super-enhancer switching drives a burst in gene expression at the mitosis-to-meiosis transition. Nature Structural & Molecular Biology. , (2020).
  21. Sakashita, A., et al. Endogenous retroviruses drive species-specific germline transcriptomes in mammals. Nature Structural & Molecular Biology. , (2020).
  22. Agrimson, K. S., et al. Characterizing the Spermatogonial Response to Retinoic Acid During the Onset of Spermatogenesis and Following Synchronization in the Neonatal Mouse Testis. Biology of Reproduction. 95 (4), 81 (2016).
  23. Hogarth, C. A., et al. Turning a spermatogenic wave into a tsunami: synchronizing murine spermatogenesis using WIN 18,446. Biology of Reproduction. 88 (2), 40 (2013).
  24. Patel, L., et al. Dynamic reorganization of the genome shapes the recombination landscape in meiotic prophase. Nature Structural & Molecular Biology. 26 (3), 164-174 (2019).
  25. Alavattam, K. G., et al. Attenuated chromatin compartmentalization in meiosis and its maturation in sperm development. Nature Structural & Molecular Biology. 26 (3), 175-184 (2019).
  26. Adams, S. R., et al. RNF8 and SCML2 cooperate to regulate ubiquitination and H3K27 acetylation for escape gene activation on the sex chromosomes. PLoS Genetics. 14 (2), 1007233 (2018).
  27. Wiltshire, T., Park, C., Caldwell, K. A., Handel, M. A. Induced premature G2/M-phase transition in pachytene spermatocytes includes events unique to meiosis. Developmental Biology. 169 (2), 557-567 (1995).

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Yeh, Y., Hu, M., Nakagawa, T., Sakashita, A., Yoshida, S., Maezawa, S., Namekawa, S. H. Isolation of Murine Spermatogenic Cells using a Violet-Excited Cell-Permeable DNA Binding Dye. J. Vis. Exp. (167), e61666, doi:10.3791/61666 (2021).

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