Aislamiento de células espermatogénicas murinas usando un tinte de unión de ADN permeable a células violetas-excitado

La espermatogénesis es un proceso complejo en el que una pequeña población de células madre espermatogoniales sostiene la producción continua de un gran número de espermatozoides a lo largo de la vida adulta^1,2. Durante la espermatogénesis, la remodelación dinámica de la cromatina tiene lugar cuando las células espermatogénicas se someten a meiosis para producir espermatozoides haploideos^3,4,5. El aislamiento de espermatocitos meyóticos es esencial para la investigación molecular, y se han establecido varios enfoques diferentes para aislar los espermatocitos meyóticos, incluyendo la separación basada en sedimentación^6,7 y la clasificación celular activada por fluorescencia (FACS)^{8,9,10,11,12,13,14,15,16,17}. Sin embargo, estos métodos tienen limitaciones técnicas. Mientras que la separación basada en sedimentación produce un gran número de células^5,6,7,es intensiva en mano de obra. El método establecido basado en FACS utiliza Hoechst 33342 (Ho342) para separar los espermatocitos meyóticos basados en el contenido de ADN y las propiedades de dispersión de luz y requiere clasificadores celulares FACS equipados con un láser ultravioleta (UV)^8,9,10,11. Los métodos alternativos basados en FACS requieren líneas de ratón transgénicas que expresen proteínas florescentes, sincronización de espermatogénesis¹²o fijación celular y etiquetado de anticuerpos que no sea compatible con el aislamiento de células vivas¹³. Si bien hay otro método alternativo utilizando un tinte de unión de ADN permeable a las células, DyeCycle Green stain^14,15,16,17, este método se recomienda para el aislamiento de células espermatogénicas de testículos juveniles. Por lo tanto, existe una necesidad crítica de desarrollar un método de aislamiento simple y robusto para los esperatocitos meyóticos vivos que se pueden aplicar a cualquier cepa de ratón de cualquier edad y que se puede realizar utilizando cualquier clasificador celular FACS.

Aquí describimos un protocolo de aislamiento celular tan buscado desde hace mucho tiempo utilizando la mancha DyeCycle Violet (DCV). El DCV es un tinte de unión de ADN permeable a la célula de baja citotoxicidad estructuralmente similar al Ho342, pero con un espectro de excitación desplazado hacia el rango violeta¹⁸. Además, DCV tiene un espectro de emisiones más amplio en comparación con DCG. Por lo tanto, puede ser excitado por láseres UV y violeta, lo que mejora la flexibilidad del equipo, permitiendo el uso de un clasificador de células FACS no equipado con un láser UV. El protocolo DCV presentado aquí utiliza la separación bidimensional con azul DCV y rojo DCV, imitando la ventaja del protocolo Ho342. Con esta ventaja, nuestro protocolo DCV nos permite aislar células germinales altamente enriquecidas de los testículos adultos. Proporcionamos un protocolo detallado para aislar las células espermatogénicas vivas de los testículos adultos de ratón de un ratón (de dos testículos). También describimos un protocolo eficiente y rápido para preparar la suspensión de una sola célula a partir de pruebas de ratón que se pueden utilizar para este aislamiento de celda. El procedimiento requiere un corto tiempo para completar (preparación de la suspensión de una sola célula – 1 hora, tinción de tinte – 30 min, y clasificación celular – 2-3 horas: total – 4-5 horas dependiendo del número de células necesarias; Figura 1). Después del aislamiento celular, se puede completar una amplia gama de aplicaciones posteriores, incluyendo RNA-seq, ATAC-seq, ChIP-seq y cultivo celular.