Изоляция murine сперматогенных клеток с помощью фиолетово-возбужденных клеток проницаемых ДНК Связывание красителя
Summary
Здесь мы представляем простой и эффективный метод изоляции живых мейотических и постмейотических зародышевых клеток от взрослых мышей. Используя низкоцитотоксичность, фиолетовый возбужденный краситель связывания ДНК и флуоресценцию активированной сортировки клеток, можно изолировать высокообогащеные популяции сперматозоидов для многих нисходящих приложений.
Abstract
Изоляция мейотических сперматозоидов имеет важное значение для исследования молекулярных механизмов, лежащих в основе мейоза и сперматогенеза. Хотя существуют установленные протоколы изоляции клеток с использованием Hoechst 33342 окрашивания в сочетании с флуоресценции активированной сортировки клеток, он требует сортировки клеток оснащен ультрафиолетовым лазером. Здесь мы описываем протокол изоляции клеток с использованием пятна DyeCycle Violet (DCV), низкого цитотоксичности ДНК связывания красителя структурно похож на Hoechst 33342. DCV может быть возбужден как ультрафиолетовых, так и фиолетовых лазеров, что повышает гибкость выбора оборудования, в том числе сортера клеток, не оснащенных ультрафиолетовым лазером. Используя этот протокол, можно изолировать три живых клеток субпопуляции в мейотической профазы I, в том числе лептотен / зиготен, пахитен, и диплотен сперматоцитов, а также пост-мейотических круглых сперматозоидов. Мы также описываем протокол для подготовки одноклеточной подвески от мышей-тестов. В целом, процедура требует короткого времени для завершения (4-5 часов в зависимости от количества необходимых ячеек), что облегчает многие приложения вниз по течению.
Introduction
Сперматогенез является сложным процессом, в котором небольшая популяция сперматозоидов стволовых клеток поддерживать непрерывное производство большого количества спермы на протяжениивсей взрослой жизни 1,2. Во время сперматогенеза, динамическая хроматин ремоделирование происходит, когда сперматозоидные клетки проходят мейоз для производства гаплоидныхсперматозоидов 3,4,5. Изоляция мейотических сперматозоидов имеет важное значение для молекулярного исследования, и несколько различных подходов к изоляции меиотических сперматозоидов были созданы, в том числеосадочных основе разделения 6,7 и флуоресценции активированныхклеток сортировки(FACS) 8,9,10,11,12,13,14,15,16,17. Однако эти методы имеют технические ограничения. В то время как разделение на основе осадочных пород даетбольшое количество клеток 5,6,7,это трудоемкий. Установленный facS-основанный метод использует Hoechst 33342 (Ho342) для того чтобы отделить meiotic сперматиноциты основанные на содержании ДНАА и светлых scattering свойствах и требует сортеров клетки FACS оборудованных с ультрафиолетовым (УФ)лазером 8,9,10,11. Альтернативные методы на основе FACS требуют трансгенных линий мыши, которые выражают флуоресцентныебелки, синхронизация сперматогенеза 12, или фиксации клеток и маркировки антител, что не совместимо с изоляцией живыхклеток 13. Хотя есть еще один альтернативный метод с использованием клеток проницаемой ДНК связывания красителя, DyeCycle Зеленыйпятно 14,15,16,17, этот метод рекомендуется для изоляции сперматозоидных клеток от несовершеннолетних яичка. Таким образом, существует критическая необходимость разработки простого и надежного метода изоляции живых мейотических сперматозоидов, которые могут быть применены к любому штамму мыши любого возраста и которые могут быть выполнены с помощью любого сортера клеток FACS.
Здесь мы описываем такой давно испрашиваемый протокол изоляции клеток с использованием пятна DyeCycle Violet (DCV). DCV является низкой цитотоксичности, клеток проницаемой ДНК связывания красителя структурно похож на Ho342, но с возбуждением спектра смещается в сторону фиолетовогодиапазона 18. Кроме того, DCV имеет более широкий спектр выбросов по сравнению с DCG. Таким образом, он может быть возбужден как УФ, так и фиолетовые лазеры, что повышает гибкость оборудования, что позволяет использовать сортер клеток FACS, не оборудованный УФ-лазером. Протокол DCV, представленный здесь, использует двумерное разделение с dcV синим и DCV красным, имитируя преимущество протокола Ho342. С этим преимуществом, наш протокол DCV позволяет нам изолировать высокообогащеные зародышевые клетки от взрослого яичка. Мы предоставляем подробный протокол закрытости, чтобы изолировать живые сперматозоидные клетки от взрослых мышей яички одной мыши (из двух яище). Мы также описываем эффективный и быстрый протокол для подготовки одноклеточной подвески от мышей испытаний, которые могут быть использованы для этой изоляции клеток. Процедура требует короткого времени (подготовка одноклеточной суспензии – 1 час, окрашивания красителя – 30 мин, а сортировки клеток – 2-3 часа: всего – 4-5 часов в зависимости от количества необходимых клеток; Рисунок 1). После изоляции ячеек может быть завершен широкий спектр приложений ниже по течению, включая РНК-сек, ATAC-seq, ChIP-seq и культуру клеток.
Protocol
Representative Results
Discussion
Здесь мы представляем практический и простой протокол для изоляции субпопуляций сперматозоидов и сперматозоидов от одного взрослого самца мыши. Для обеспечения воспроизводимости этого протокола необходимо принять некоторые важные меры. Перед перевариванием ферментов, мыть шаг напр…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим сотрудников лабораторий Намекава, Есида и Маэдзава за помощь; Кэти Герхардт для редактирования рукописи; Мэри Энн Гендель для обмена H1T антитела, Цинциннати Детская больница медицинский центр (CCHMC) Научно-исследовательский поток цитометрии ядро для обмена оборудование FACS при поддержке NIH S10OD023410; Грант-в-помощи для научных исследований (KAKENHI; 17K07424) к T.N.; Постдокторантство Фонда Лалора А.С.; AMED-CREST (JP17gm110005h0001) до S.Y.; грант исследовательского проекта, предоставленный Отделом исследовательских услуг Университета Азабу, Министерство образования, культуры, спорта, науки и техники (MEXT) – поддерживаемая программа проекта по брендингу частных университетов (2016-2019), Грант-в-помощи для научно-исследовательской деятельности Start-up (19K21196), Научный фонд Такеды (2019), и Uehara Memorial Foundation Research Incentive Грант (2018) для S.M.; Национальный институт здравоохранения R01 GM122776 до S.H.N.
Materials
| 1.5 ml tube | Watson | 131-7155C | |
| 100 mm Petri dish | Corning, Falcon | 351029 | |
| 15 mL Centrifuge tube | Watson | 1332-015S | |
| 5 ml polystyrene tube with cell strainer snap cap (35 µm nylon mesh) | Corning, Falcon | 352235 | |
| 50 mL Centrifuge tube | Watson | 1342-050S | |
| 60 mm Petri dish | Corning, Falcon | 351007 | |
| 70 µm nylon mesh | Corning, Falcon | 352350 | |
| Cell sorter | Sony | SH800S | |
| Centrifuge | |||
| Collagenase, recombinant, Animal-derived-free | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 036-23141 | |
| Collagenase, Type 1 | Worthington | LS004196 | |
| Cover glass | Fisher | 12-544-G | |
| Cytospin 3 | Shandon | ||
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Fisher | D1306 | working concentration: 0.1 μg/mL |
| Dnase I | Sigma | D5025-150KU | |
| Donkey serum | Sigma | S30-M | |
| Dulbecco’s phosphate-buffered saline (DPBS) | Gibco | 14190144 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 11885076 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 16000044 | |
| Hostone H1T antibody | gift from Mary Ann Handel | 1/2000 diluted | |
| Hank’s balanced salt solution (HBSS) | Gibco | 14175095 | |
| Hyaluronidase from bovine testes | Sigma | H3506-1G | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma | P5493-4L | |
| Pipettemen | |||
| ProLong Gold Antifade Mountant | Fisher | P36930 | |
| rH2AX antibody | Millipore | 05-635 | working concentration: 2 μg/mL |
| Sperm Fertilization Protein 56 (Sp56) antibody | QED Bioscience | 55101 | working concentration: 0.5 μg/mL |
| Sterilized forceps and scissors | |||
| Superfrost /Plus Microscope Slides | Fisher | 12-550-15 | |
| SYCP3 antibody | Abcam | ab205846 | working concentration: 5 μg/mL |
| TWEEN 20 (Polysorbate 20) | Sigma | P9416 | |
| Vybrant DyeCycle Violet Stain (DCV) | Invitrogen | V35003 | |
| Water bath |
References
- Griswold, M. D. Spermatogenesis: The Commitment to Meiosis. Physiological Reviews. 96 (1), 1-17 (2016).
- Yoshida, S. Mouse Spermatogenesis Reflects the Unity and Diversity of Tissue Stem Cell Niche Systems. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. , 036186 (2020).
- Rathke, C., Baarends, W. M., Awe, S., Renkawitz-Pohl, R. Chromatin dynamics during spermiogenesis. Biochimica et Biophysica Acta. 1839 (3), 155-168 (2014).
- Maezawa, S., et al. SCML2 promotes heterochromatin organization in late spermatogenesis. Journal of Cell Science. 131 (17), 217125 (2018).
- Maezawa, S., Yukawa, M., Alavattam, K. G., Barski, A., Namekawa, S. H. Dynamic reorganization of open chromatin underlies diverse transcriptomes during spermatogenesis. Nucleic Acids Research. 46 (2), 593-608 (2018).
- Bellve, A. R. Purification, culture, and fractionation of spermatogenic cells. Methods in Enzymology. 225, 84-113 (1993).
- Bryant, J. M., Meyer-Ficca, M. L., Dang, V. M., Berger, S. L., Meyer, R. G. Separation of spermatogenic cell types using STA-PUT velocity sedimentation. Journal of Visualized Experiments. (80), e50648 (2013).
- Gaysinskaya, V., Bortvin, A. Flow cytometry of murine spermatocytes. Current Protocols in Cytometry. 72, (2015).
- Bastos, H., et al. Flow cytometric characterization of viable meiotic and postmeiotic cells by Hoechst 33342 in mouse spermatogenesis. Cytometry Part A. 65 (1), 40-49 (2005).
- Getun, I. V., Torres, B., Bois, P. R. Flow cytometry purification of mouse meiotic cells. Journal of Visualized Experimments. (50), e2602 (2011).
- Gaysinskaya, V., Soh, I. Y., van der Heijden, G. W., Bortvin, A. Optimized flow cytometry isolation of murine spermatocytes. Cytometry Part A. 85 (6), 556-565 (2014).
- Romer, K. A., de Rooiji, D. G., Kojima, M. L., Page, D. C. Isolating mitotic and meiotic germ cells from male mice by developmental synchronization, staging, and sorting. Developmental Biology. 443 (1), 19-34 (2018).
- Lam, K. G., Brick, K., Cheng, G., Pratto, F., Camerini-Otero, R. D. Cell-type-specific genomics reveals histone modification dynamics in mammalian meiosis. Nature Communications. 10 (1), 3821 (2019).
- Geisinger, A., Rodriguez-Casuriaga, R. Flow Cytometry for the Isolation and Characterization of Rodent Meiocytes. Methods in Molecular Biology. 1471, 217-230 (2017).
- da Cruz, I., et al. Transcriptome analysis of highly purified mouse spermatogenic cell populations: gene expression signatures switch from meiotic-to postmeiotic-related processes at pachytene stage. BMC Genomics. 17, 294 (2016).
- Rodriguez-Casuriaga, R., et al. Rapid preparation of rodent testicular cell suspensions and spermatogenic stages purification by flow cytometry using a novel blue-laser-excitable vital dye. MethodsX. 1, 239-243 (2014).
- Trovero, M. F., et al. Revealing stage-specific expression patterns of long noncoding RNAs along mouse spermatogenesis. RNA Biology. 17 (3), 350-365 (2020).
- Telford, W. G., Bradford, J., Godfrey, W., Robey, R. W., Bates, S. E. Side population analysis using a violet-excited cell-permeable DNA binding dye. Stem Cells. 25 (4), 1029-1036 (2007).
- Alavattam, K. G., Abe, H., Sakashita, A., Namekawa, S. H. Chromosome Spread Analyses of Meiotic Sex Chromosome Inactivation. Methods in Molecular Biology. 1861, 113-129 (2018).
- Maezawa, S., et al. Super-enhancer switching drives a burst in gene expression at the mitosis-to-meiosis transition. Nature Structural & Molecular Biology. , (2020).
- Sakashita, A., et al. Endogenous retroviruses drive species-specific germline transcriptomes in mammals. Nature Structural & Molecular Biology. , (2020).
- Agrimson, K. S., et al. Characterizing the Spermatogonial Response to Retinoic Acid During the Onset of Spermatogenesis and Following Synchronization in the Neonatal Mouse Testis. Biology of Reproduction. 95 (4), 81 (2016).
- Hogarth, C. A., et al. Turning a spermatogenic wave into a tsunami: synchronizing murine spermatogenesis using WIN 18,446. Biology of Reproduction. 88 (2), 40 (2013).
- Patel, L., et al. Dynamic reorganization of the genome shapes the recombination landscape in meiotic prophase. Nature Structural & Molecular Biology. 26 (3), 164-174 (2019).
- Alavattam, K. G., et al. Attenuated chromatin compartmentalization in meiosis and its maturation in sperm development. Nature Structural & Molecular Biology. 26 (3), 175-184 (2019).
- Adams, S. R., et al. RNF8 and SCML2 cooperate to regulate ubiquitination and H3K27 acetylation for escape gene activation on the sex chromosomes. PLoS Genetics. 14 (2), 1007233 (2018).
- Wiltshire, T., Park, C., Caldwell, K. A., Handel, M. A. Induced premature G2/M-phase transition in pachytene spermatocytes includes events unique to meiosis. Developmental Biology. 169 (2), 557-567 (1995).
