בידוד של תאי זרע מורין באמצעות צבע מחייב DNA סגול-נרגש תא חרוש
Summary
כאן אנו מציגים שיטה פשוטה ויעילה לבודד תאי חיידקים מיוטיים ופוסט-מיוטיים חיים מערכי עכבר בוגרים. באמצעות ציטוקסיות נמוכה, צבע מחייב DNA סגול-נרגש ומיון תאים המופעלים על-ידי פלואורסצנה, ניתן לבודד אוכלוסיות תאי זרע מועשרים מאוד עבור יישומים רבים במורד הזרם.
Abstract
בידוד של spermatocytes מיוטי חיוני כדי לחקור מנגנונים מולקולריים הבסיסיים מיוזיס ו spermatogenesis. למרות שיש פרוטוקולי בידוד תאים הוקמה באמצעות ההכתמה Hoechst 33342 בשילוב עם מיון תאים המופעלים על-ידי פלואורסצנה, זה דורש סדרנים תא מצויד לייזר אולטרה סגול. כאן אנו מתארים פרוטוקול בידוד תאים באמצעות כתם סיגלית DyeCycle (DCV), צבע מחייב DNA cytotoxicity נמוך דומה מבנית Hoechst 33342. DCV יכול להתרגש הן על ידי לייזרים אולטרה סגולים והן סגול, אשר משפר את הגמישות של בחירת ציוד, כולל סדרן תאים לא מצויד בלייזר אולטרה סגול. באמצעות פרוטוקול זה, ניתן לבודד שלוש תת-אוכלוסיות של תאים חיים ב-prophase meiotic I, כולל לפטוטן/זיגוטן, פאצ’יטים, וזרעונים דיפלוטן, כמו גם זרעונים עגולים פוסט מיוטיים. אנו גם מתארים פרוטוקול להכנת השעיה חד-תאית מכיסכי עכבר. בסך הכל, ההליך דורש זמן קצר כדי להשלים (4-5 שעות בהתאם למספר התאים הדרושים), אשר מקל על יישומים רבים במורד הזרם.
Introduction
Spermatogenesis הוא תהליך מורכב שבו אוכלוסייה קטנה של תאי גזע spermatogonial לקיים ייצור רציף של מספר גדול של זרעלאורך החיים הבוגרים 1,2. במהלך spermatogenesis, שיפוץ כרומטין דינמי מתרחש כאשר תאי זרע עוברים meiosis לייצר זרעונים haploid3,4,5. בידוד זרעונים מיוטיים חיוני לחקירה מולקולרית, ונקבעו מספר גישות שונות לבידוד זרעון מיוטי, כולל הפרדה מבוססת מום6,7 ומיון תאים המופעל על-ידי פלואורסצנטיות (FACS)8,9,10,11,12,13,14,15,16,17. עם זאת, שיטות אלה כוללות מגבלות טכניות. בעוד שהפרדה מבוססת מום מניבה מספר גדול של תאים5,6,7, היא דורשת עבודה אינטנסיבית. השיטה מבוססת FACS הוקמה משתמשת Hoechst 33342 (Ho342) כדי להפריד spermatocytes meiotic מבוסס על תוכן DNA ומאפייני פיזור אור ודורש סדרני תאים FACS מצויד אולטרה סגול (UV)לייזר 8,9,10,11. שיטות חלופיות מבוססות FACS דורשות קווי עכבר טרנסגניים המבטאים חלבוני פלורסנט, סנכרון של spermatogenesis12, או קיבעון תאים ותווית נוגדנים שאינם תואמים לבידוד של תאיםחיים 13. אמנם יש שיטה חלופית אחרת באמצעות צבע מחייב DNA חרוש תא, DyeCycle גריןכתם 14,15,16,17, שיטה זו מומלצת לבידוד של תאי זרע מאסכים צעירים. לכן, יש צורך קריטי לפתח שיטת בידוד פשוטה וחזקה עבור spermatocytes meiotic חי שניתן להחיל על כל זן העכבר בכל גיל, כי ניתן לבצע באמצעות כל סדרן תאים FACS.
כאן אנו מתארים פרוטוקול כזה ארוך זמן בידוד תאים באמצעות כתם סיגלית DyeCycle (DCV). DCV הוא cytotoxicity נמוך, תא חיר DNA מחייב צבע דומה מבנית Ho342 אבל עם ספקטרום עירור נע לכיוון טווח סגול18. בנוסף, DCV יש ספקטרום פליטה רחב יותר בהשוואה DCG. לכן, זה יכול להיות נרגש על ידי לייזרים UV וסגול, אשר משפר את הגמישות של ציוד, המאפשר את השימוש של סדרן תאים FACS לא מצויד בלייזר UV. פרוטוקול DCV המוצג כאן משתמש בהפרדה דו-ממדית עם כחול DCV ואדום DCV, המחקה את היתרון של פרוטוקול Ho342. עם יתרון זה, פרוטוקול DCV שלנו מאפשר לנו לבודד תאי נבט מועשר מאוד מן האשכים למבוגרים. אנו מספקים פרוטוקול גתור מפורט כדי לבודד תאי זרע חיים מאסחי עכבר בוגרים של עכבר אחד (משני אשכים). כמו כן, אנו מתארים פרוטוקול יעיל ומהיר להכנת השעיה חד-תאית מכיסכי עכבר שניתן להשתמש בהם לבידוד תא זה. ההליך דורש זמן קצר כדי להשלים (הכנה של מתלה תא יחיד – 1 שעה, כתמי צבע – 30 דקות, ומיון תאים – 2-3 שעות: סה”כ – 4-5 שעות בהתאם למספר התאים הדרושים; איור 1). לאחר בידוד תאים, ניתן להשלים מגוון רחב של יישומים במורד הזרם, כולל RNA-seq, ATAC-seq, ChIP-seq ותרבות תאים.
Protocol
Representative Results
Discussion
כאן אנו מציגים פרוטוקול מעשי ופשוט לבודד תת-אוכלוסיות של spermatocytes וזרעון מעכבר זכר בוגר אחד. כדי להבטיח את האפשרות לשחזור של פרוטוקול זה, קיימים מספר שלבים קריטיים הזקוקים לתשומת לב. לפני עיכול אנזימים, שלב לשטוף שואף להסיר תאים interstitial; לאחר העיכול, שלב זה מסייע להסיר spermatozoa ופסולת. כביסה / צנ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לחברי מעבדות נמקאווה, יושידה ומזאווה על עזרתם; קייטי גרהרט לעריכת כתב היד; מרי אן הנדל לשיתוף הנוגדן H1T, המרכז הרפואי לילדים בסינסינטי (CCHMC) מחקר זרימה Cytometry Core לשיתוף ציוד FACS נתמך על ידי NIH S10OD023410; מענק בסיוע למחקר מדעי (KAKENHI; 17K07424) ל-T.N.; מלגת פוסט-ת’ורי של קרן ללור לא.ס.; AMED-CREST (JP17gm110005h0001) עד ס.י.; מענק פרויקט המחקר על ידי חטיבת שירותי המחקר של אוניברסיטת אזבו, משרד החינוך, התרבות, הספורט, המדע והטכנולוגיה (MEXT)-נתמך בתוכנית עבור פרויקט המיתוג של האוניברסיטה הפרטית למחקר (2016-2019), מענק-בסיוע לסטארט-אפ פעילות מחקרית (19K21196), קרן המדע טוקדה (2019) ומענק תמריץ המחקר של קרן אוהרה (2018) ל-S.M.; המכון הלאומי לבריאות R01 GM122776 ל S.H.N.
Materials
| 1.5 ml tube | Watson | 131-7155C | |
| 100 mm Petri dish | Corning, Falcon | 351029 | |
| 15 mL Centrifuge tube | Watson | 1332-015S | |
| 5 ml polystyrene tube with cell strainer snap cap (35 µm nylon mesh) | Corning, Falcon | 352235 | |
| 50 mL Centrifuge tube | Watson | 1342-050S | |
| 60 mm Petri dish | Corning, Falcon | 351007 | |
| 70 µm nylon mesh | Corning, Falcon | 352350 | |
| Cell sorter | Sony | SH800S | |
| Centrifuge | |||
| Collagenase, recombinant, Animal-derived-free | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 036-23141 | |
| Collagenase, Type 1 | Worthington | LS004196 | |
| Cover glass | Fisher | 12-544-G | |
| Cytospin 3 | Shandon | ||
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Fisher | D1306 | working concentration: 0.1 μg/mL |
| Dnase I | Sigma | D5025-150KU | |
| Donkey serum | Sigma | S30-M | |
| Dulbecco’s phosphate-buffered saline (DPBS) | Gibco | 14190144 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 11885076 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 16000044 | |
| Hostone H1T antibody | gift from Mary Ann Handel | 1/2000 diluted | |
| Hank’s balanced salt solution (HBSS) | Gibco | 14175095 | |
| Hyaluronidase from bovine testes | Sigma | H3506-1G | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma | P5493-4L | |
| Pipettemen | |||
| ProLong Gold Antifade Mountant | Fisher | P36930 | |
| rH2AX antibody | Millipore | 05-635 | working concentration: 2 μg/mL |
| Sperm Fertilization Protein 56 (Sp56) antibody | QED Bioscience | 55101 | working concentration: 0.5 μg/mL |
| Sterilized forceps and scissors | |||
| Superfrost /Plus Microscope Slides | Fisher | 12-550-15 | |
| SYCP3 antibody | Abcam | ab205846 | working concentration: 5 μg/mL |
| TWEEN 20 (Polysorbate 20) | Sigma | P9416 | |
| Vybrant DyeCycle Violet Stain (DCV) | Invitrogen | V35003 | |
| Water bath |
References
- Griswold, M. D. Spermatogenesis: The Commitment to Meiosis. Physiological Reviews. 96 (1), 1-17 (2016).
- Yoshida, S. Mouse Spermatogenesis Reflects the Unity and Diversity of Tissue Stem Cell Niche Systems. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. , 036186 (2020).
- Rathke, C., Baarends, W. M., Awe, S., Renkawitz-Pohl, R. Chromatin dynamics during spermiogenesis. Biochimica et Biophysica Acta. 1839 (3), 155-168 (2014).
- Maezawa, S., et al. SCML2 promotes heterochromatin organization in late spermatogenesis. Journal of Cell Science. 131 (17), 217125 (2018).
- Maezawa, S., Yukawa, M., Alavattam, K. G., Barski, A., Namekawa, S. H. Dynamic reorganization of open chromatin underlies diverse transcriptomes during spermatogenesis. Nucleic Acids Research. 46 (2), 593-608 (2018).
- Bellve, A. R. Purification, culture, and fractionation of spermatogenic cells. Methods in Enzymology. 225, 84-113 (1993).
- Bryant, J. M., Meyer-Ficca, M. L., Dang, V. M., Berger, S. L., Meyer, R. G. Separation of spermatogenic cell types using STA-PUT velocity sedimentation. Journal of Visualized Experiments. (80), e50648 (2013).
- Gaysinskaya, V., Bortvin, A. Flow cytometry of murine spermatocytes. Current Protocols in Cytometry. 72, (2015).
- Bastos, H., et al. Flow cytometric characterization of viable meiotic and postmeiotic cells by Hoechst 33342 in mouse spermatogenesis. Cytometry Part A. 65 (1), 40-49 (2005).
- Getun, I. V., Torres, B., Bois, P. R. Flow cytometry purification of mouse meiotic cells. Journal of Visualized Experimments. (50), e2602 (2011).
- Gaysinskaya, V., Soh, I. Y., van der Heijden, G. W., Bortvin, A. Optimized flow cytometry isolation of murine spermatocytes. Cytometry Part A. 85 (6), 556-565 (2014).
- Romer, K. A., de Rooiji, D. G., Kojima, M. L., Page, D. C. Isolating mitotic and meiotic germ cells from male mice by developmental synchronization, staging, and sorting. Developmental Biology. 443 (1), 19-34 (2018).
- Lam, K. G., Brick, K., Cheng, G., Pratto, F., Camerini-Otero, R. D. Cell-type-specific genomics reveals histone modification dynamics in mammalian meiosis. Nature Communications. 10 (1), 3821 (2019).
- Geisinger, A., Rodriguez-Casuriaga, R. Flow Cytometry for the Isolation and Characterization of Rodent Meiocytes. Methods in Molecular Biology. 1471, 217-230 (2017).
- da Cruz, I., et al. Transcriptome analysis of highly purified mouse spermatogenic cell populations: gene expression signatures switch from meiotic-to postmeiotic-related processes at pachytene stage. BMC Genomics. 17, 294 (2016).
- Rodriguez-Casuriaga, R., et al. Rapid preparation of rodent testicular cell suspensions and spermatogenic stages purification by flow cytometry using a novel blue-laser-excitable vital dye. MethodsX. 1, 239-243 (2014).
- Trovero, M. F., et al. Revealing stage-specific expression patterns of long noncoding RNAs along mouse spermatogenesis. RNA Biology. 17 (3), 350-365 (2020).
- Telford, W. G., Bradford, J., Godfrey, W., Robey, R. W., Bates, S. E. Side population analysis using a violet-excited cell-permeable DNA binding dye. Stem Cells. 25 (4), 1029-1036 (2007).
- Alavattam, K. G., Abe, H., Sakashita, A., Namekawa, S. H. Chromosome Spread Analyses of Meiotic Sex Chromosome Inactivation. Methods in Molecular Biology. 1861, 113-129 (2018).
- Maezawa, S., et al. Super-enhancer switching drives a burst in gene expression at the mitosis-to-meiosis transition. Nature Structural & Molecular Biology. , (2020).
- Sakashita, A., et al. Endogenous retroviruses drive species-specific germline transcriptomes in mammals. Nature Structural & Molecular Biology. , (2020).
- Agrimson, K. S., et al. Characterizing the Spermatogonial Response to Retinoic Acid During the Onset of Spermatogenesis and Following Synchronization in the Neonatal Mouse Testis. Biology of Reproduction. 95 (4), 81 (2016).
- Hogarth, C. A., et al. Turning a spermatogenic wave into a tsunami: synchronizing murine spermatogenesis using WIN 18,446. Biology of Reproduction. 88 (2), 40 (2013).
- Patel, L., et al. Dynamic reorganization of the genome shapes the recombination landscape in meiotic prophase. Nature Structural & Molecular Biology. 26 (3), 164-174 (2019).
- Alavattam, K. G., et al. Attenuated chromatin compartmentalization in meiosis and its maturation in sperm development. Nature Structural & Molecular Biology. 26 (3), 175-184 (2019).
- Adams, S. R., et al. RNF8 and SCML2 cooperate to regulate ubiquitination and H3K27 acetylation for escape gene activation on the sex chromosomes. PLoS Genetics. 14 (2), 1007233 (2018).
- Wiltshire, T., Park, C., Caldwell, K. A., Handel, M. A. Induced premature G2/M-phase transition in pachytene spermatocytes includes events unique to meiosis. Developmental Biology. 169 (2), 557-567 (1995).
