Summary

Isolement des cellules spermatogéniques murines à l’aide d’un colorant liant à l’ADN perméable à la cellule violette

Published: January 14, 2021
doi:

Summary

Ici, nous présentons une méthode simple et efficace pour isoler les cellules germinales méiotiques et post-méiotiques vivantes des testicules adultes de souris. À l’aide d’une faible cytotoxicité, d’un colorant liant l’ADN violet et d’un tri cellulaire activé par fluorescence, on peut isoler des populations de cellules spermatogéniques hautement enrichies pour de nombreuses applications en aval.

Abstract

L’isolement des spermatocytes méiotiques est essentiel pour étudier les mécanismes moléculaires sous-jacents à la méiose et à la spermatogenèse. Bien qu’il existe des protocoles établis d’isolement cellulaire à l’aide de la coloration Hoechst 33342 en combinaison avec le tri cellulaire activé par fluorescence, il nécessite des trieurs cellulaires équipés d’un laser ultraviolet. Ici nous décrivons un protocole d’isolement cellulaire utilisant la tache de violet de DyeCycle (DCV), un colorant liant d’ADN de basse cytotoxicité structurellement semblable à Hoechst 33342. DCV peut être excité par les lasers ultraviolets et violets, ce qui améliore la flexibilité du choix de l’équipement, y compris un trieur de cellules non équipé d’un laser ultraviolet. En utilisant ce protocole, on peut isoler trois sous-populations de cellules vivantes dans la prophase méiotique I, y compris le leptotene/zygotène, le pachytene et les spermatocytes diplotènes, ainsi que les spermatides ronds post-méiotiques. Nous décrivons également un protocole pour préparer la suspension à cellule unique à partir de testicules de souris. Dans l’ensemble, la procédure nécessite un court laps de temps à compléter (4-5 heures selon le nombre de cellules nécessaires), ce qui facilite de nombreuses applications en aval.

Introduction

La spermatogenèse est un processus complexe dans lequel une petite population de cellules souches spermatogoniales soutiennent la production continue d’un grand nombre de spermatozoïdes tout au long de lavie adulte 1,2. Pendant la spermatogenèse, le remodelage dynamique de chromatine a lieu quand les cellules spermatogenic subissent la méiose pour produire des spermatides haploïdes3,4,5. L’isolement des spermatocytes méiotiques est essentiel à l’investigation moléculaire, et plusieurs approches différentes pour isoler les spermatocytes méiotiques ont été établies, y compris la séparation basée sur la sédimentation6,7 et le tri cellulaire activé par fluorescence (FACS)8,9,10,11,12,13,14,15,16,17. Toutefois, ces méthodes ont des limites techniques. Alors que la séparation basée sur la sédimentation donne un grand nombre de cellules 5 ,6,7,ilestà forte intensité de main-d’œuvre. La méthode établie à base de FACS utilise Hoechst 33342 (Ho342) pour séparer les spermatocytes méiotiques en fonction de la teneur en ADN et des propriétés de diffusion de la lumière et nécessite des trieurs cellulaires FACS équipés d’un laser ultraviolet (UV)8,9,10,11. D’autres méthodes à base de FACS nécessitent des lignées de souris transgéniques qui expriment des protéines florescentes, la synchronisation de la spermatogenèse12,ou la fixation cellulaire et l’étiquetage des anticorps qui n’est pas compatible avec l’isolement des cellulesvivantes 13. Bien qu’il existe une autre méthode alternative utilisant un colorant liant l’ADN perméable à la cellule, DyeCycle Green tache14,15,16,17, cette méthode est recommandée pour l’isolement des cellules spermatogenic de testicules juvéniles. Par conséquent, il y a un besoin critique de développer une méthode simple et robuste d’isolement pour les spermatocytes méiotiques vivants qui peuvent être appliqués à n’importe quelle souche de souris de n’importe quel âge et qui peuvent être exécutés utilisant n’importe quel trieur de cellules facs.

Ici, nous décrivons un tel protocole d’isolement cellulaire recherché depuis longtemps en utilisant la tache DyeCycle Violet (DCV). Le DCV est une faible cytotoxicité, un colorant liant l’ADN perméable aux cellules structurellement similaire à Ho342, mais avec un spectre d’excitation déplacé vers la gammeviolette 18. En outre, DCV a un spectre d’émissions plus large par rapport à DCG. Ainsi, il peut être excité par les lasers UV et violets, ce qui améliore la flexibilité de l’équipement, permettant l’utilisation d’un trieur de cellules FACS non équipé d’un laser UV. Le protocole DCV présenté ici utilise la séparation bidimensionnelle avec le bleu DCV et le rouge DCV, imitant l’avantage du protocole Ho342. Avec cet avantage, notre protocole DCV nous permet d’isoler les cellules germinales hautement enrichies des testicules adultes. Nous fournissons un protocole de gating détaillé pour isoler les cellules spermatogenic vivantes des testicules adultes de souris d’une souris (de deux testicules). Nous décrivons également un protocole efficace et rapide pour préparer la suspension à cellule unique à partir de testicules de souris qui peuvent être utilisés pour cet isolement cellulaire. La procédure nécessite un court laps de temps (préparation de la suspension à cellule unique – 1 heure, colorant – 30 min, et le tri cellulaire – 2-3 heures: total – 4-5 heures selon le nombre de cellules nécessaires; Figure 1). Après l’isolement cellulaire, un large éventail d’applications en aval, y compris l’ARN-seq, ATAC-seq, ChIP-seq, et la culture cellulaire peuvent être complétés.

Protocol

Ce protocole suit les lignes directrices du Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux (protocole no. IACUC2018-0040) au Cincinnati Children’s Hospital Medical Center. 1. Installation d’équipement et de reagent pour la préparation de la suspension des cellules testiculaires Préparer chaque stock d’enzymes dans la solution de sel équilibré (HBSS) de Hanks et les conserver à -20 °C.REMARQUE : Préparez-vous à tout moment avant l’…

Representative Results

Un résultat représentatif de ce protocole de tri est indiqué à la figure 3. Le temps total de tri de deux testicules (une souris) est généralement d’environ 3 heures, ce qui dépend de la concentration de suspension cellulaire et de la vitesse de tri. Après le tri, la pureté des spermatocytes est confirmée par l’immunostaining de SYCP3 et γH2AX (Figure 3A). La pureté représentative des fractions triées de spermatocytes L/Z, P, D est d’environ …

Discussion

Ici nous présentons un protocole pratique et simple pour isoler des sous-populations des spermatocytes et des spermatds d’une souris mâle adulte simple. Pour assurer la reproductibilité de ce protocole, certaines étapes critiques doivent être prises. Avant la digestion des enzymes, l’étape de lavage vise à éliminer les cellules interstitielles; après digestion, cette étape aide à enlever le spermatozoa et les débris. Le lavage/centrifugage 3 fois est important. Dans notre recette tampon de dissociation, l…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nous remercions les membres des laboratoires Namekawa, Yoshida et Maezawa pour leur aide; Katie Gerhardt pour l’édition du manuscrit; Mary Ann Handel pour avoir partagé l’anticorps H1T, le centre de cytométrie de flux de recherche du Cincinnati Children’s Hospital Medical Center (CCHMC) pour le partage de l’équipement FACS soutenu par nih S10OD023410; Subvention d’aide à la recherche scientifique (KAKENHI; 17K07424) à T.N.; Bourse postdoctorale de la Fondation Lalor aux AA; AMED-CREST (JP17gm1110005h0001) à S.Y.; la subvention du projet de recherche de la Division des services de recherche de l’Université d’Azabu, Programme soutenu par le ministère de l’Éducation, de la Culture, des Sports, des Sciences et de la Technologie (MEXT) pour le Projet d’image de marque de la recherche universitaire privée (2016-2019), la subvention d’aide au démarrage d’activités de recherche (19K21196), la Takeda Science Foundation (2019) et la Subvention pour l’encouragement à la recherche de la Fondation commémorative Uehara (2018) à S.M.; National Institute of Health R01 GM122776 à S.H.N.

Materials

1.5 ml tube Watson 131-7155C
100 mm Petri dish Corning, Falcon 351029
15 mL Centrifuge tube Watson 1332-015S
5 ml polystyrene tube with cell strainer snap cap (35 µm nylon mesh) Corning, Falcon 352235
50 mL Centrifuge tube Watson 1342-050S
60 mm Petri dish Corning, Falcon 351007
70 µm nylon mesh Corning, Falcon 352350
Cell sorter Sony SH800S
Centrifuge
Collagenase, recombinant, Animal-derived-free FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation 036-23141
Collagenase, Type 1 Worthington LS004196
Cover glass Fisher 12-544-G
Cytospin 3 Shandon
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) Fisher D1306 working concentration: 0.1 μg/mL
Dnase I Sigma D5025-150KU
Donkey serum Sigma S30-M
Dulbecco’s phosphate-buffered saline (DPBS) Gibco 14190144
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Gibco 11885076
Fetal bovine serum (FBS) Gibco 16000044
Hostone H1T antibody gift from Mary Ann Handel 1/2000 diluted
Hank’s balanced salt solution (HBSS) Gibco 14175095
Hyaluronidase from bovine testes Sigma H3506-1G
Phosphate buffered saline (PBS) Sigma P5493-4L
Pipettemen
ProLong Gold Antifade Mountant Fisher P36930
rH2AX antibody Millipore 05-635 working concentration: 2 μg/mL
Sperm Fertilization Protein 56 (Sp56) antibody QED Bioscience 55101 working concentration: 0.5 μg/mL
Sterilized forceps and scissors
Superfrost /Plus Microscope Slides Fisher 12-550-15
SYCP3 antibody Abcam ab205846 working concentration: 5 μg/mL
TWEEN 20 (Polysorbate 20) Sigma P9416
Vybrant DyeCycle Violet Stain (DCV) Invitrogen V35003
Water bath

References

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Yeh, Y., Hu, M., Nakagawa, T., Sakashita, A., Yoshida, S., Maezawa, S., Namekawa, S. H. Isolation of Murine Spermatogenic Cells using a Violet-Excited Cell-Permeable DNA Binding Dye. J. Vis. Exp. (167), e61666, doi:10.3791/61666 (2021).

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