Isolement des cellules spermatogéniques murines à l’aide d’un colorant liant à l’ADN perméable à la cellule violette

La spermatogenèse est un processus complexe dans lequel une petite population de cellules souches spermatogoniales soutiennent la production continue d’un grand nombre de spermatozoïdes tout au long de la^{vie adulte 1,2}. Pendant la spermatogenèse, le remodelage dynamique de chromatine a lieu quand les cellules spermatogenic subissent la méiose pour produire des spermatides haploïdes^3,4,5. L’isolement des spermatocytes méiotiques est essentiel à l’investigation moléculaire, et plusieurs approches différentes pour isoler les spermatocytes méiotiques ont été établies, y compris la séparation basée sur la sédimentation^6,7 et le tri cellulaire activé par fluorescence (FACS)^{8,9,10,11,12,13,14,15,16,17}. Toutefois, ces méthodes ont des limites techniques. Alors que la séparation basée sur la sédimentation donne un grand nombre de cellules 5 ,^6,7,il^està forte intensité de main-d’œuvre. La méthode établie à base de FACS utilise Hoechst 33342 (Ho342) pour séparer les spermatocytes méiotiques en fonction de la teneur en ADN et des propriétés de diffusion de la lumière et nécessite des trieurs cellulaires FACS équipés d’un laser ultraviolet (UV)^8,9,10,11. D’autres méthodes à base de FACS nécessitent des lignées de souris transgéniques qui expriment des protéines florescentes, la synchronisation de la spermatogenèse^12,ou la fixation cellulaire et l’étiquetage des anticorps qui n’est pas compatible avec l’isolement des cellules^{vivantes 13}. Bien qu’il existe une autre méthode alternative utilisant un colorant liant l’ADN perméable à la cellule, DyeCycle Green tache^14,15,16,17, cette méthode est recommandée pour l’isolement des cellules spermatogenic de testicules juvéniles. Par conséquent, il y a un besoin critique de développer une méthode simple et robuste d’isolement pour les spermatocytes méiotiques vivants qui peuvent être appliqués à n’importe quelle souche de souris de n’importe quel âge et qui peuvent être exécutés utilisant n’importe quel trieur de cellules facs.

Ici, nous décrivons un tel protocole d’isolement cellulaire recherché depuis longtemps en utilisant la tache DyeCycle Violet (DCV). Le DCV est une faible cytotoxicité, un colorant liant l’ADN perméable aux cellules structurellement similaire à Ho342, mais avec un spectre d’excitation déplacé vers la gamme^{violette 18}. En outre, DCV a un spectre d’émissions plus large par rapport à DCG. Ainsi, il peut être excité par les lasers UV et violets, ce qui améliore la flexibilité de l’équipement, permettant l’utilisation d’un trieur de cellules FACS non équipé d’un laser UV. Le protocole DCV présenté ici utilise la séparation bidimensionnelle avec le bleu DCV et le rouge DCV, imitant l’avantage du protocole Ho342. Avec cet avantage, notre protocole DCV nous permet d’isoler les cellules germinales hautement enrichies des testicules adultes. Nous fournissons un protocole de gating détaillé pour isoler les cellules spermatogenic vivantes des testicules adultes de souris d’une souris (de deux testicules). Nous décrivons également un protocole efficace et rapide pour préparer la suspension à cellule unique à partir de testicules de souris qui peuvent être utilisés pour cet isolement cellulaire. La procédure nécessite un court laps de temps (préparation de la suspension à cellule unique – 1 heure, colorant – 30 min, et le tri cellulaire – 2-3 heures: total – 4-5 heures selon le nombre de cellules nécessaires; Figure 1). Après l’isolement cellulaire, un large éventail d’applications en aval, y compris l’ARN-seq, ATAC-seq, ChIP-seq, et la culture cellulaire peuvent être complétés.