Summary

Isolierung von murinen Spermatogenic Cells mit einem violett-erregten Zellpermeable DNA Binding Dye

Published: January 14, 2021
doi:

Summary

Hier präsentieren wir eine einfache und effiziente Methode, um lebende meiotische und postmeiotische Keimzellen von erwachsenen Maushoden zu isolieren. Mit einem zytotoxischen, violett-erregten DNA-Bindungsfarbstoff und fluoreszenzaktivierter Zellsortierung kann man hoch angereicherte spermatogene Zellpopulationen für viele nachgelagerte Anwendungen isolieren.

Abstract

Die Isolierung meiotischer Spermatozyten ist wichtig, um molekulare Mechanismen zu untersuchen, die der Meiose und Spermatogenese zugrunde liegen. Obwohl es etablierte Zellisolationsprotokolle mit Hoechst 33342 Färbung in Kombination mit fluoreszenzaktivierter Zellsortierung gibt, sind Zellsortierer mit einem ultravioletten Laser erforderlich. Hier beschreiben wir ein Zellisolationsprotokoll mit dem DyeCycle Violet (DCV) Fleck, einem DNA-Bindungsfarbstoff mit geringer Zytotoxizität, der Hoechst 33342 strukturell ähnelt. DCV kann sowohl von ultravioletten als auch von violetten Lasern angeregt werden, was die Flexibilität der Geräteauswahl verbessert, einschließlich eines Zellsortierers, der nicht mit einem ultravioletten Laser ausgestattet ist. Mit diesem Protokoll kann man drei lebende Zellsubpopulationen in der meiotischen Prophase I isolieren, einschließlich Leptotene/Zygoten, Pachyten und Diploten-Spermatozyten sowie postmetiotische runde Spermatien. Wir beschreiben auch ein Protokoll zur Vorbereitung der einzelzelligen Suspension von Maushoden. Insgesamt benötigt das Verfahren eine kurze Zeit (4-5 Stunden abhängig von der Anzahl der benötigten Zellen), was viele nachgelagerte Anwendungen erleichtert.

Introduction

Spermatogenese ist ein komplexer Prozess, bei dem eine kleine Population von SpermatogonialStammzellen die kontinuierliche Produktion einer großen Anzahl von Spermien während des Erwachsenenlebens1,2aufrechterhält. Während der Spermatogenese findet die dynamische Chromatin-Remodellierung statt, wenn spermatogene Zellen einer Meiose unterzogen werden, um haploide Spermaatiden3,4,5zu produzieren. Die Isolierung meiotischer Spermatozyten ist für die molekulare Untersuchung von wesentlicher Bedeutung, und es wurden verschiedene Ansätze zur Isolierung meiotischer Spermatozyten etabliert, einschließlich sedimentationsbasierter Trennung6,7 und fluoreszenzaktivierter Zellsortierung (FACS)8,9,10,11,12,13,14,15,16,17. Diese Methoden haben jedoch technische Einschränkungen. Während sedimentationsbasierte Trennung eine große Anzahl von Zellenergibt 5,6,7, ist es arbeitsintensiv. Die etablierte FACS-basierte Methode verwendet Hoechst 33342 (Ho342), um meiotische Spermatozyten basierend auf DNA-Gehalt und Lichtstreuungseigenschaften zu trennen und erfordert FACS-Zellsortierer, die mit einem ultravioletten (UV) Laser8,9,10,11ausgestattet sind. Alternative FACS-basierte Methoden erfordern transgene Mauslinien, die floreszierende Proteine ausdrücken, Synchronisation von Spermatogenese12oder Zellfixierung und Antikörperkennzeichnung, die nicht mit der Isolierung von lebenden Zellen kompatibel ist13. Zwar gibt es eine andere alternative Methode mit einem zelldurchlässigen DNA-Bindungsfarbstoff, DyeCycle Green Stain14,15,16,17, Diese Methode wird für die Isolierung von spermaatogenen Zellen aus juvenilen Hoden empfohlen. Daher besteht die kritische Notwendigkeit, eine einfache und robuste Isolationsmethode für lebende meiotische Spermatozyten zu entwickeln, die auf jeden Mausstamm jeden Alters angewendet werden können und mit jedem FACS-Zellsortierer durchgeführt werden können.

Hier beschreiben wir ein so lang ersehntes Zellisolationsprotokoll mit dem DyeCycle Violet (DCV) Fleck. DCV ist ein geringer Zytotoxizität, zelldurchlässiger DNA-Bindungsfarbstoff strukturell ähnlich Ho342, aber mit einem Anregungsspektrum in Richtung des violetten Bereichs18verschoben. Darüber hinaus verfügt DCV über ein breiteres Emissionsspektrum im Vergleich zu DCG. So kann es sowohl durch UV- als auch violette Laser angeregt werden, was die Flexibilität der Geräte verbessert, so dass ein FACS-Zellsortierer nicht mit einem UV-Laser ausgestattet ist. Das hier vorgestellte DCV-Protokoll verwendet eine zweidimensionale Trennung mit DCV-Blau und DCV-Rot, was den Vorteil des Ho342-Protokolls nachahmt. Mit diesem Vorteil ermöglicht uns unser DCV-Protokoll, hoch angereicherte Keimzellen aus den adulten Hoden zu isolieren. Wir bieten ein detailliertes Gating-Protokoll, um lebende spermatogene Zellen von erwachsenen Maushoden einer Maus (aus zwei Hoden) zu isolieren. Wir beschreiben auch ein effizientes und schnelles Protokoll zur Vorbereitung einer einzelzelligen Suspension aus Maushoden, die für diese Zellisolierung verwendet werden können. Das Verfahren erfordert eine kurze Zeit zu vervollständigen (Vorbereitung der einzelzelligen Suspension – 1 Stunde, Farbstoff Färbung – 30 min, und Zellsortierung – 2-3 Stunden: insgesamt – 4-5 Stunden abhängig von der Anzahl der benötigten Zellen; Abbildung 1). Nach der Zellisolation kann eine breite Palette von nachgelagerten Anwendungen wie RNA-seq, ATAC-seq, ChIP-seq und Zellkultur abgeschlossen werden.

Protocol

Dieses Protokoll folgt den Richtlinien des Institutionellen Ausschusses für Tierpflege und -nutzung (Protokoll Nr. IACUC2018-0040) im Cincinnati Children es Hospital Medical Center. 1. Ausrüstungs- und Reagenzaufbau zur Herstellung der Hodenzellsuspension Bereiten Sie jeden Enzymbestand in 1x Hanks’ Balanced Salt Solution (HBSS) vor und lagern Sie bei -20 °C . (Tabelle1).HINWEIS: Bereiten Sie jederzeit vor dem Experiment vor. Einen Tag vor dem Experi…

Representative Results

Ein repräsentatives Ergebnis dieses Sortierprotokolls ist in Abbildung 3dargestellt. Die Gesamtsortierzeit von zwei Hoden (eine Maus) beträgt in der Regel etwa 3 Stunden, was von der Konzentration der Zellsuspension und der Sortiergeschwindigkeit abhängt. Nach der Sortierung wird die Reinheit der Spermatozyten durch Immunfärbung von SYCP3 und H2AX bestätigt (Abbildung 3A). Die repräsentative Reinheit der sortierten L/Z-, P-, D-Spermatozytenfraktionen betr?…

Discussion

Hier stellen wir ein praktisches und einfaches Protokoll vor, um Subpopulationen von Spermatozyten und Spermatoren aus einer einzigen erwachsenen männlichen Maus zu isolieren. Um die Reproduzierbarkeit dieses Protokolls zu gewährleisten, gibt es einige wichtige Schritte, die Aufmerksamkeit erfordern. Vor der Enzymverdauung, Waschschritt zielt darauf ab, interstitielle Zellen zu entfernen; nach der Verdauung hilft dieser Schritt, Spermatozoen und Schmutz zu entfernen. Waschen/Zentrieren ist wichtig. In unserem Dissoziat…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir danken den Mitgliedern der Laboratorien Namekawa, Yoshida und Maezawa für ihre Hilfe; Katie Gerhardt für die Bearbeitung des Manuskripts; Mary Ann Händel für die gemeinsame Nutzung des H1T-Antikörpers, des Cincinnati Children es Hospital Medical Center (CCHMC) Research Flow Cytometry Core für die gemeinsame Nutzung der FACS-Ausrüstung, die von NIH S10OD023410 unterstützt wird; Grant-in-Aid for Scientific Research (KAKENHI; 17K07424) an T.N.; Lalor Foundation Postdoktorandenstipendium an A.S.; AMED-CREST (JP17gm1110005h0001) nach S.Y.; das Forschungsprojekt Grant von der Azabu University Research Services Division, Ministry of Education, Culture, Sports, Science and Technology (MEXT)-Supported Program for the Private University Research Branding Project (2016–2019), Grant-in-Aid for Research Activity Start-up (19K21196), the Takeda Science Foundation (2019) und dem Uehara Memorial Memorial Foundation Research Incentive Grant (2018) an S.M.; National Institute of Health R01 GM122776 bis S.H.N.

Materials

1.5 ml tube Watson 131-7155C
100 mm Petri dish Corning, Falcon 351029
15 mL Centrifuge tube Watson 1332-015S
5 ml polystyrene tube with cell strainer snap cap (35 µm nylon mesh) Corning, Falcon 352235
50 mL Centrifuge tube Watson 1342-050S
60 mm Petri dish Corning, Falcon 351007
70 µm nylon mesh Corning, Falcon 352350
Cell sorter Sony SH800S
Centrifuge
Collagenase, recombinant, Animal-derived-free FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation 036-23141
Collagenase, Type 1 Worthington LS004196
Cover glass Fisher 12-544-G
Cytospin 3 Shandon
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) Fisher D1306 working concentration: 0.1 μg/mL
Dnase I Sigma D5025-150KU
Donkey serum Sigma S30-M
Dulbecco’s phosphate-buffered saline (DPBS) Gibco 14190144
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Gibco 11885076
Fetal bovine serum (FBS) Gibco 16000044
Hostone H1T antibody gift from Mary Ann Handel 1/2000 diluted
Hank’s balanced salt solution (HBSS) Gibco 14175095
Hyaluronidase from bovine testes Sigma H3506-1G
Phosphate buffered saline (PBS) Sigma P5493-4L
Pipettemen
ProLong Gold Antifade Mountant Fisher P36930
rH2AX antibody Millipore 05-635 working concentration: 2 μg/mL
Sperm Fertilization Protein 56 (Sp56) antibody QED Bioscience 55101 working concentration: 0.5 μg/mL
Sterilized forceps and scissors
Superfrost /Plus Microscope Slides Fisher 12-550-15
SYCP3 antibody Abcam ab205846 working concentration: 5 μg/mL
TWEEN 20 (Polysorbate 20) Sigma P9416
Vybrant DyeCycle Violet Stain (DCV) Invitrogen V35003
Water bath

References

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Yeh, Y., Hu, M., Nakagawa, T., Sakashita, A., Yoshida, S., Maezawa, S., Namekawa, S. H. Isolation of Murine Spermatogenic Cells using a Violet-Excited Cell-Permeable DNA Binding Dye. J. Vis. Exp. (167), e61666, doi:10.3791/61666 (2021).

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