Isolamento delle cellule spermatogeniche murine utilizzando un colorante legante del DNA permeabile alle cellule violetto

La spermatogenesi è un processo complesso in cui una piccola popolazione di cellule staminali spermatogoniche sostiene la produzione continua di un gran numero di spermatozoi per tutta la^{vita adulta 1,2}. Durante la spermatogenesi, il rimodellamento dinamico della cromatina avviene quando le cellule spermatogeniche subiscono meiosi per produrre spermatidi aploidi^3,4,5. L’isolamento degli spermatociti meiotici è essenziale per l’indagine molecolare e sono stati stabiliti diversi approcci per isolare gli spermatociti meiotici, tra cui la separazione basata sulla sedimentazione^6,7 e lo smistamento cellulare attivato dalla fluorescenza (FACS)^{8,9,10,11,12,13,14,15,16,17}. Tuttavia, questi metodi hanno limitazioni tecniche. Mentre la separazione basata sulla sedimentazione produce un gran numero di^{cellule 5,6,7}, è ad alta intensità di lavoro. Il metodo stabilito basato su FACS utilizza Hoechst 33342 (Ho342) per separare gli spermatociti meiotici in base al contenuto di DNA e alle proprietà di scattering della luce e richiede smistatori cellulari FACS dotati di un laser ultravioletto (UV)^8,9,10,11. Metodi alternativi basati su FACS richiedono linee di topo transgeniche che esprimono proteine florescenti, sincronizzazione della spermatogenesi¹²o fissazione cellulare ed etichettatura degli anticorpi che non è compatibile con l’isolamento delle cellule^{vive 13}. Mentre esiste un altro metodo alternativo che utilizza un colorante legante al DNA permeabile alle cellule, colorante DyeCycle Green^14,15,16,17, questo metodo è raccomandato per l’isolamento delle cellule spermatogeniche dal testicolo giovanile. Pertanto, è fondamentale sviluppare un metodo di isolamento semplice e robusto per gli spermatociti meiotici vivi che possono essere applicati a qualsiasi ceppo di topo di qualsiasi età e che possono essere eseguiti utilizzando qualsiasi smistatore di celle FACS.

Qui descriviamo un protocollo di isolamento cellulare così ricercato da tempo usando la macchia DyeCycle Violet (DCV). Il DCV è un colorante legante il DNA a bassa citotossicità e permeabile alle cellule strutturalmente simile all’Ho342, ma con uno spettro di eccitazione spostato verso l’intervallo viola¹⁸. Inoltre, il DCV ha uno spettro di emissione più ampio rispetto al DCG. Pertanto, può essere eccitato sia dai laser UV che viola, che migliorano la flessibilità delle apparecchiature, consentendo l’uso di uno smistatore di celle FACS non dotato di un laser UV. Il protocollo DCV qui presentato utilizza la separazione bidimensionale con blu DCV e rosso DCV, imitando il vantaggio del protocollo Ho342. Con questo vantaggio, il nostro protocollo DCV ci consente di isolare le cellule germinali altamente arricchite dal testicolo adulto. Forniamo un protocollo di gating dettagliato per isolare le cellule spermatogeniche vive dai tester di topo adulti di un topo (da due teste). Descriviamo anche un protocollo efficiente e rapido per preparare sospensioni a cella singola dai test del mouse che possono essere utilizzati per questo isolamento cellulare. La procedura richiede un breve tempo per essere completata (preparazione della sospensione a cella singola – 1 ora, colorazione del colorante – 30 minuti e smistamento delle cellule – 2-3 ore: totale – 4-5 ore a seconda del numero di celle necessarie; Figura 1). A seguito dell’isolamento cellulare, è possibile completare un’ampia gamma di applicazioni downstream tra cui RNA-seq, ATAC-seq, ChIP-seq e coltura cellulare.