Isolatie van Murine Spermatogenic Cellen met behulp van een Violet-Excited Cell-Permeable DNA Binding Dye
Summary
Hier presenteren we een eenvoudige en efficiënte methode om levende meiotische en post-meiotische kiemcellen te isoleren van volwassen muispesten. Met behulp van een lage cytotoxiciteit, violet-opgewonden DNA bindende kleurstof en fluorescentie-geactiveerde celsorde, kan men zeer verrijkte spermatogene celpopulaties isoleren voor vele downstream toepassingen.
Abstract
Isolatie van meiotische spermatocyten is essentieel om moleculaire mechanismen te onderzoeken die ten grondslag liggen aan meiose en spermatogenese. Hoewel er gevestigde celisolatieprotocollen zijn met Hoechst 33342-kleuring in combinatie met fluorescentie-geactiveerde celsorling, vereist het celsorteerders die zijn uitgerust met een ultraviolette laser. Hier beschrijven we een celisolatie protocol met behulp van de DyeCycle Violet (DCV) vlek, een lage cytotoxiciteit DNA binding kleurstof structureel vergelijkbaar met Hoechst 33342. DCV kan worden opgewekt door zowel ultraviolette als violet lasers, die de flexibiliteit van de apparatuur keuze verbetert, met inbegrip van een cel sorteerder niet uitgerust met een ultraviolette laser. Met behulp van dit protocol kan men drie live-cel subpopulaties isoleren in meiotische profase I, waaronder leptotene/zygotene, pachytene en diplotene spermatocyten, evenals post-meiotische ronde spermatids. We beschrijven ook een protocol voor een eencellige suspensie van muistestes. Over het algemeen vereist de procedure een korte tijd om te voltooien (4-5 uur, afhankelijk van het aantal benodigde cellen), wat veel downstreamtoepassingen vergemakkelijkt.
Introduction
Spermatogenese is een complex proces waarbij een kleine populatie spermatogonale stamcellen een continue productie van een groot aantal sperma gedurende het hele volwassen leven gedurende1,2. Tijdens spermatogenese vindt dynamische chromatine remodellering plaats wanneer spermatogene cellen meiose ondergaan om haploïde spermatids3,4,5te produceren . Isolatie van meiotische spermatocyten is essentieel voor moleculair onderzoek en er zijn verschillende benaderingen vastgesteld om meiotische zaadcyten te isoleren, waaronder scheiding op basis van sedimentatie6,7 en fluorescentie-geactiveerde celsordening (FACS)8,9,10,11,12,13,14,15,16,17. Deze methoden hebben echter technische beperkingen. Terwijl sedimentatie gebaseerde scheiding levert een groot aantal cellen5,6,7, het is arbeidsintensief. De gevestigde FACS-gebaseerde methode maakt gebruik van Hoechst 33342 (Ho342) om meiotische zaadtomen te scheiden op basis van DNA-inhoud en lichtverstrooiingseigenschappen en vereist FACS-celsorteerders die zijn uitgerust met een ultraviolette (UV) laser8,9,10,11. Alternatieve FACS-gebaseerde methoden vereisen transgene muislijnen die fluorescerende eiwitten uitdrukken, synchronisatie van spermatogenese12, of celfixatie en antilichaamlabeling die niet compatibel is met isolatie van levende cellen13. Hoewel er een andere alternatieve methode met behulp van een cel-permeabele DNA-bindende kleurstof, DyeCycle Groene vlek14,15,16,17, deze methode wordt aanbevolen voor de isolatie van spermatogene cellen van jeugdige testis. Daarom is er een kritische behoefte om een eenvoudige en robuuste isolatiemethode te ontwikkelen voor levende meiotische spermatocyten die kunnen worden toegepast op elke muisstam van elke leeftijd en die kan worden uitgevoerd met behulp van een FACS-celsorteerder.
Hier beschrijven we zo’n lang gezocht celisolatieprotocol met behulp van de DyeCycle Violet (DCV) vlek. DCV is een lage cytotoxiciteit, cel-permeabele DNA bindende kleurstof structureel vergelijkbaar met Ho342, maar met een excitatie spectrum verschoven naar de violette bereik18. Daarnaast heeft DCV een breder emissiespectrum in vergelijking met DCG. Zo kan het worden opgewekt door zowel UV-en violet lasers, die de flexibiliteit van de apparatuur verbetert, waardoor het gebruik van een FACS cel sorteerder niet uitgerust met een UV-laser. Het DCV-protocol dat hier wordt gepresenteerd, maakt gebruik van tweedimensionale scheiding met DCV-blauw en DCV-rood, waarbij het voordeel van het Ho342-protocol wordt nagebootst. Met dit voordeel stelt ons DCV-protocol ons in staat om sterk verrijkte kiemcellen te isoleren van de volwassen testis. We bieden een gedetailleerd gating protocol om levende spermatogene cellen te isoleren van volwassen muispesten van één muis (van twee teelballen). We beschrijven ook een efficiënt en snel protocol voor de voorbereiding van eencellige suspensie van muistestes die kunnen worden gebruikt voor deze celisolatie. De procedure vereist een korte tijd om te voltooien (voorbereiding van eencellige suspensie – 1 uur, kleurstof – 30 min, en celsorde – 2-3 uur: totaal – 4-5 uur, afhankelijk van het aantal benodigde cellen; Figuur 1). Na celisolatie kan een breed scala aan downstreamtoepassingen, waaronder RNA-seq, ATAC-seq, ChIP-seq en celcultuur, worden voltooid.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier presenteren we een praktisch en eenvoudig protocol om subpopulaties van spermatocyten en spermatids te isoleren van een enkele volwassen mannelijke muis. Om de reproduceerbaarheid van dit protocol te waarborgen, zijn er enkele kritieke stappen die aandacht nodig hebben. Vóór enzymvertering, wasstap is gericht op het verwijderen van interstitiële cellen; na de spijsvertering, deze stap helpt om spermatozoa en puin te verwijderen. Wassen/centrifugeren 3 keer is belangrijk. In ons dissociatiebufferrecept vergemakkel…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken leden van de laboratoria Namekawa, Yoshida en Maezawa voor hun hulp; Katie Gerhardt voor het bewerken van het manuscript; Mary Ann Händel voor het delen van de H1T antilichaam, de Cincinnati Children’s Hospital Medical Center (CCHMC) Research Flow Cytometrie Core voor het delen van de FACS apparatuur ondersteund door NIH S10OD023410; Grant-in-Aid for Scientific Research (KAKENHI; 17K07424) aan T.N.; Lalor Foundation Postdoctoral Fellowship naar A.S.; AMED-CREST (JP17gm1110005h0001) aan S.Y.; de Onderzoeksprojectsubsidie van de Azabu University Research Services Division, Ministry of Education, Culture, Sports, Science and Technology (MEXT)-Ondersteund Programma voor het Private University Research Branding Project (2016-2019), Grant-in-Aid for Research Activity Start-up (19K21196), de Takeda Science Foundation (2019) en de Uehara Memorial Foundation Research Incentive Grant (2018) aan S.M.; National Institute of Health R01 GM122776 naar S.H.N.
Materials
| 1.5 ml tube | Watson | 131-7155C | |
| 100 mm Petri dish | Corning, Falcon | 351029 | |
| 15 mL Centrifuge tube | Watson | 1332-015S | |
| 5 ml polystyrene tube with cell strainer snap cap (35 µm nylon mesh) | Corning, Falcon | 352235 | |
| 50 mL Centrifuge tube | Watson | 1342-050S | |
| 60 mm Petri dish | Corning, Falcon | 351007 | |
| 70 µm nylon mesh | Corning, Falcon | 352350 | |
| Cell sorter | Sony | SH800S | |
| Centrifuge | |||
| Collagenase, recombinant, Animal-derived-free | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 036-23141 | |
| Collagenase, Type 1 | Worthington | LS004196 | |
| Cover glass | Fisher | 12-544-G | |
| Cytospin 3 | Shandon | ||
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Fisher | D1306 | working concentration: 0.1 μg/mL |
| Dnase I | Sigma | D5025-150KU | |
| Donkey serum | Sigma | S30-M | |
| Dulbecco’s phosphate-buffered saline (DPBS) | Gibco | 14190144 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 11885076 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 16000044 | |
| Hostone H1T antibody | gift from Mary Ann Handel | 1/2000 diluted | |
| Hank’s balanced salt solution (HBSS) | Gibco | 14175095 | |
| Hyaluronidase from bovine testes | Sigma | H3506-1G | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma | P5493-4L | |
| Pipettemen | |||
| ProLong Gold Antifade Mountant | Fisher | P36930 | |
| rH2AX antibody | Millipore | 05-635 | working concentration: 2 μg/mL |
| Sperm Fertilization Protein 56 (Sp56) antibody | QED Bioscience | 55101 | working concentration: 0.5 μg/mL |
| Sterilized forceps and scissors | |||
| Superfrost /Plus Microscope Slides | Fisher | 12-550-15 | |
| SYCP3 antibody | Abcam | ab205846 | working concentration: 5 μg/mL |
| TWEEN 20 (Polysorbate 20) | Sigma | P9416 | |
| Vybrant DyeCycle Violet Stain (DCV) | Invitrogen | V35003 | |
| Water bath |
References
- Griswold, M. D. Spermatogenesis: The Commitment to Meiosis. Physiological Reviews. 96 (1), 1-17 (2016).
- Yoshida, S. Mouse Spermatogenesis Reflects the Unity and Diversity of Tissue Stem Cell Niche Systems. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. , 036186 (2020).
- Rathke, C., Baarends, W. M., Awe, S., Renkawitz-Pohl, R. Chromatin dynamics during spermiogenesis. Biochimica et Biophysica Acta. 1839 (3), 155-168 (2014).
- Maezawa, S., et al. SCML2 promotes heterochromatin organization in late spermatogenesis. Journal of Cell Science. 131 (17), 217125 (2018).
- Maezawa, S., Yukawa, M., Alavattam, K. G., Barski, A., Namekawa, S. H. Dynamic reorganization of open chromatin underlies diverse transcriptomes during spermatogenesis. Nucleic Acids Research. 46 (2), 593-608 (2018).
- Bellve, A. R. Purification, culture, and fractionation of spermatogenic cells. Methods in Enzymology. 225, 84-113 (1993).
- Bryant, J. M., Meyer-Ficca, M. L., Dang, V. M., Berger, S. L., Meyer, R. G. Separation of spermatogenic cell types using STA-PUT velocity sedimentation. Journal of Visualized Experiments. (80), e50648 (2013).
- Gaysinskaya, V., Bortvin, A. Flow cytometry of murine spermatocytes. Current Protocols in Cytometry. 72, (2015).
- Bastos, H., et al. Flow cytometric characterization of viable meiotic and postmeiotic cells by Hoechst 33342 in mouse spermatogenesis. Cytometry Part A. 65 (1), 40-49 (2005).
- Getun, I. V., Torres, B., Bois, P. R. Flow cytometry purification of mouse meiotic cells. Journal of Visualized Experimments. (50), e2602 (2011).
- Gaysinskaya, V., Soh, I. Y., van der Heijden, G. W., Bortvin, A. Optimized flow cytometry isolation of murine spermatocytes. Cytometry Part A. 85 (6), 556-565 (2014).
- Romer, K. A., de Rooiji, D. G., Kojima, M. L., Page, D. C. Isolating mitotic and meiotic germ cells from male mice by developmental synchronization, staging, and sorting. Developmental Biology. 443 (1), 19-34 (2018).
- Lam, K. G., Brick, K., Cheng, G., Pratto, F., Camerini-Otero, R. D. Cell-type-specific genomics reveals histone modification dynamics in mammalian meiosis. Nature Communications. 10 (1), 3821 (2019).
- Geisinger, A., Rodriguez-Casuriaga, R. Flow Cytometry for the Isolation and Characterization of Rodent Meiocytes. Methods in Molecular Biology. 1471, 217-230 (2017).
- da Cruz, I., et al. Transcriptome analysis of highly purified mouse spermatogenic cell populations: gene expression signatures switch from meiotic-to postmeiotic-related processes at pachytene stage. BMC Genomics. 17, 294 (2016).
- Rodriguez-Casuriaga, R., et al. Rapid preparation of rodent testicular cell suspensions and spermatogenic stages purification by flow cytometry using a novel blue-laser-excitable vital dye. MethodsX. 1, 239-243 (2014).
- Trovero, M. F., et al. Revealing stage-specific expression patterns of long noncoding RNAs along mouse spermatogenesis. RNA Biology. 17 (3), 350-365 (2020).
- Telford, W. G., Bradford, J., Godfrey, W., Robey, R. W., Bates, S. E. Side population analysis using a violet-excited cell-permeable DNA binding dye. Stem Cells. 25 (4), 1029-1036 (2007).
- Alavattam, K. G., Abe, H., Sakashita, A., Namekawa, S. H. Chromosome Spread Analyses of Meiotic Sex Chromosome Inactivation. Methods in Molecular Biology. 1861, 113-129 (2018).
- Maezawa, S., et al. Super-enhancer switching drives a burst in gene expression at the mitosis-to-meiosis transition. Nature Structural & Molecular Biology. , (2020).
- Sakashita, A., et al. Endogenous retroviruses drive species-specific germline transcriptomes in mammals. Nature Structural & Molecular Biology. , (2020).
- Agrimson, K. S., et al. Characterizing the Spermatogonial Response to Retinoic Acid During the Onset of Spermatogenesis and Following Synchronization in the Neonatal Mouse Testis. Biology of Reproduction. 95 (4), 81 (2016).
- Hogarth, C. A., et al. Turning a spermatogenic wave into a tsunami: synchronizing murine spermatogenesis using WIN 18,446. Biology of Reproduction. 88 (2), 40 (2013).
- Patel, L., et al. Dynamic reorganization of the genome shapes the recombination landscape in meiotic prophase. Nature Structural & Molecular Biology. 26 (3), 164-174 (2019).
- Alavattam, K. G., et al. Attenuated chromatin compartmentalization in meiosis and its maturation in sperm development. Nature Structural & Molecular Biology. 26 (3), 175-184 (2019).
- Adams, S. R., et al. RNF8 and SCML2 cooperate to regulate ubiquitination and H3K27 acetylation for escape gene activation on the sex chromosomes. PLoS Genetics. 14 (2), 1007233 (2018).
- Wiltshire, T., Park, C., Caldwell, K. A., Handel, M. A. Induced premature G2/M-phase transition in pachytene spermatocytes includes events unique to meiosis. Developmental Biology. 169 (2), 557-567 (1995).
