الانصهار الميتوكوندريا هو رد فعل هام في الحالة المثلية الكامنة في ديناميات الميتوكوندريا. هو موضح هنا هو نظام إعادة تشكيل في المختبر لدراسة الميتوكوندريا الداخلية الغشاء الانصهار التي يمكن حل الربط الغشاء، والالتحام، hemifusion، وفتح المسام. وتناقش براعة هذا النهج في استكشاف أنظمة غشاء الخلية.
ديناميات الميتوكوندريا أمر ضروري لوظائف الجهاز المتنوعة والاستجابات الخلوية. الغشاء الميتوكوندريا المزدحم والمعقد مكانياً هو بيئة صعبة للتمييز بين العوامل التنظيمية. يمكن أن تساعد السيطرة التجريبية على مكونات البروتين والدهون في الإجابة على أسئلة محددة للتنظيم. ومع ذلك، فإن التلاعب الكمي بهذه العوامل يشكل تحدياً في عمليات الفحص الخلوي. للتحقيق في الآلية الجزيئية للدمج داخل الغشاء الميتوكوندريا، قدمنا منصة إعادة تشكيل في المختبر الذي يحاكي البيئة الدهنية للغشاء الداخلي الميتوكوندريا. هنا نحن وصف خطوات مفصلة لإعداد ثنائيات الدهون وإعادة تكوين بروتينات غشاء الميتوكوندريا. سمحت المنصة بتحليل الوسيطات في الانصهار الداخلي للغشاء الميتوكوندريا، والحركيات للتحولات الفردية، بطريقة كمية. يصف هذا البروتوكول تلفيق الطبقات الثنائية ذات التركيب غير المتماثل للدهون ويصف الاعتبارات العامة لإعادة تكوين بروتينات التعقيب إلى طبقة ثنائية مُوسَّدة. ويمكن تطبيق هذه الطريقة لدراسة أنظمة الأغشية الأخرى.
غشاء تقسيم هو السمة المميزة للخلايا eukaryotic1 (الشكل 1A). الأغشية البيولوجية هي المعترف بها على نحو متزايد باعتبارها أكثر من مذيب ثنائي الأبعاد، وتعتبر بيئة تلعب أدوارا حاسمة في تنظيم وظيفة البروتين ومجمعات الماكرو الجزيئاتالمجمعة 2،3. الدهون الأصلية هي يغاندس التي تنظم نشاط البروتين الغشائي3,4. التنظيم المكاني غشاء وقدرة الأغشية على أن تكون منحوتة في أشكال متنوعة هي الخصائص الفيزيائية الهامة لاختيار وظائف جديدة3،5.
منصات غشاء نموذج هي نظم المحاكاة الحيوية التي يمكن أن تساعدنا على فهم بنية الغشاء الخلوية، وديناميات، ودالة6،,7،,8. أغشية النموذج عادة ما تشمل خليط من الدهون تكوين واضح المعالم، مع خصائص بيوفيزيائية محددة (صلابة، سمك، ومرونة). إلى جانب التصوير المفلور، تسمح منصات الغشاء النموذجي بإجراء تحليل كمي لهيكل الغشاء والوظائف9و10,,و11. وقد استخدمت استراتيجيات إعادة تشكيل ثنائي الطبقات الدهون لدراسةالانصهارالغشاء 9 –10،الانصهار غشاء الحمض النووي بوساطة12، والانصهار الفيروسي11،13. ومن مزايا هذه الأساليب إمكانية الحصول على معلومات حركية عن الخطوات الوسيطة التي تسبق حدث رد فعل يمكن ملاحظته14.
وقد درس غشاء البلازما على نطاق واسع باستخدام أغشية نموذج. Bilayers مع فصل مرحلة الدهون وقد وضعت لدراسة هياكل طوف الدهون الهامة في الإشارات الخلوية11،15،16. Micropatterned الدهون ثنائية الطبقات17,18 وقد استخدمت للتحقيق في تنظيم مستقبلات الخلايا. وقد استخدمت البوليمر أو الأغشية المعتمدة هلام كأنظمة المحاكاة الحيوية لدراسة منظمة غشاء-cytoskeleton، غشاء تقسيم البروتين أثناء إشارات الخلية، والهجرة في اتصالات الخلية الخلية19.
كما يتم تطبيق أنظمة الأغشية الاصطناعية لدراسة العضيات دون الخلوية20. تتميز العضيات بـ morphologies المميزة التي تخلق بيئات فرعية متميزة. شبكة إندوبلاسميك (ER) شبكة (ER) هو مثال واحد. عند إعادة تشكيل الـ reticulons في ليبوسومات، يتم تشكيل هياكل الغشاء الأنبوبي مع خصائص مشابهة لـ ERالخلوية 21. إضافة أطلستين، بروتين الانصهار ER، يمكن أن تحفز أنابيب الدهون من liposomes لتشكيل شبكة20. هذا هو مثال واحد لكيفية proteoliposomes يمكن أن توفر نظرة وظيفية في مورفولوجيا الجهازية والديناميات.
الانصهار الغشاء الميتوكوندريا والانشطار ضرورية لصحة السكان الميتوكوندريا22,23,24,25. مجموعة من dynamin الأسرة GTPases يحفز الميتوكوندريا غشاء الانصهار. mfn 1/2 يحفز الانصهار الخارجي للغشاء. Opa1 يتوسط داخل الغشاء الانصهار26 (الشكل 1B). Opa1 له شكلان: شكل طويل (l-Opa1)، عبر الميمبرين الراسية على الغشاء الداخلي الميتوكوندريا، وشكل قصير “قابل للذوبان” (s-Opa1)، موجود في الفضاء intermembrane. يتم تنظيم نسبة من أشكال Opa1 اثنين من النشاط من اثنين من proteases, Oma1 و Yme1L27,28,29,30. أسئلة هامة في تنظيم Opa1 تشمل: كيف أن شكلين من Opa1، (قصيرة وطويلة) توسط الانصهار الغشاء والتفاعل التنظيمي28،29،31،32،33.
هنا نحن وصف استراتيجية إعادة تشكيل تطبيقها بنجاح للتحقيق في الاندماج داخل الغشاء الميتوكوندريا التي أوضحت أدوار ل- وS-Opa1 في الانصهار داخل الغشاء. قمنا بتطوير منصة تحاكي الغشاء الداخلي الميتوكوندريا باستخدام ثنائية الدهون البوليمر المربوطة و 200 نانومتر يونيميللار vesicles. فوائد حبل البوليمر تحت ثنائي الدهون وتشمل ما يلي. أولاً، يحافظ على بروتين الأراضي المُرَمَرَس المعاد تشكيله، والذي قد يتعطل لولا ذلك بسبب القرب من الشريحة الزجاجية34. ثانيا، فإنه يخدم طبقة المياه السميكة بين ثنائي الدهون وركيزة الزجاج، مما يسهل الدراسات من فتح المسام9، وثالثا طبيعة اللزوجة من البوليمر PEG يسمح غشاء انحناء التغييرات35. استخدمنا التصوير المفلور ثلاثي الألوان لتوصيف الخطوات في الانصهار الغشاء(الشكل 1C-F).
الشكل 1: رصد الانصهار الغشاء الميتوكوندريا.
(أ)العضيات هي مقصورات الغشاء الخلوي. (ب) الخطوات المتتابعة من الانصهار غشاء الميتوكوندريا. يتم تحفيز الانصهار في الغشاء الخارجي للميتوكوندريا بواسطة Mfn1 و /أو Mfn2 ، في حين يتم توسط الانصهار داخل الغشاء بواسطة Opa1. (C-F) التخطيطي لمنصة إعادة تشكيل في المختبر لدراسة الانصهار غشاء الميتوكوندريا. تتضمن المنصة جزأين: بروتيوليبوس وbilayer الدهون المربوطة بالبوليمر ، وكلاهما مع l-Opa1 المعاد تشكيلها. تساعد تسميات الفلورسنت، بما في ذلك نوعان مختلفان من الأصباغ الفلورية وعلامة المحتوى، في تمييز الخطوات أثناء الانصهار الغشاء. علامة الغشاء اثنين (Cy5-PE (الأحمر) و TexasRed PE (البرتقالي) جعل زوج فريت، والتي يمكن أن تقدم تقريرا عن الالتحام غشاء وثيق. نشر TexasRed-PE أن تسميات proteoliposome هو مؤشر على نصف الدهون (هدم). يتم مراقبة إصدار المحتوى من خلال إزالة نقش إشارة الكالسين (الموضح باللون الأخضر). تم إنشاء اللوحات A و B باستخدام Biorender. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
في المختبر نموذج غشاء نظم يمكن أن تصف عمليات الأغشية المعقدة في ظل ظروف محددة جيدا. هذه الأنظمة يمكن أن تميز الحد الأدنى من المكونات اللازمة للعمليات الجزيئية المعقدة للكشف عن الآليات الجزيئية6،15،20،38. بالنسبة للبروتينات الغشائية، فإن الليبوسومات والطبقات الثنائية المدعومة من البلاونات هي أنظمة إعادة تشكيل شائعة. على النقيض من ثنائيات الدهون المدعومة من المواد الصلبة ، فإن وسادة البوليمر بين الركيزة والغشاء المدعوم في الطبقات الثنائية المربوطة بالبوليمر تسمح بحرية التنقل من بروتينات الأغشية الكبيرة ، وبروتينات الغشاء المُجمب لنشر وتجميعها بحرية34. هذه الميزات ساعدتنا على التحقيق في حركية الميتوكوندريا داخل الغشاءالانصهار 36.
أعددنا ثنائي ثنائية الدهون البوليمرية المربوطة باستخدام تقنيات Langmuir-Blodgett/Langmuir-Schaefer (LB/LS). وهذا يسمح لنا بإعداد ثنائي الطبقات مع مكونات الدهون غير المتماثلة. الأغشية الخلوية لها تكوين منشور غير متماثل، والنهج LB /LS يسمح بدراسة هذه الطبقات. مع نقل شيفر، يمكن تغطية الركيزة الزجاجية بأكملها من قبل ثنائي الدهون. من المهم إعداد سطح نظيف لإعداد الطبقات. بالإضافة إلى ذلك، فإنه يأخذ الممارسة لتنفيذ نقل شايفر بشكل صحيح. نقل شيفر غير ناجحة يمكن أن تخلق عيوب غير مرغوب فيها في ثنائي الدهون. في هذا البروتوكول، الضغط المضافة إلى توازن الفيلم ينطبق على bilayer تحتوي على 20٪ cardiolipin. بالنسبة للطبقات الثنائية مع المكونات الأخرى، راجع ايزوثرم مساحة الضغط السطحي للمكونات الرئيسية. طريقة بديلة هي طريقة الانصهار Langmuir-Blodgett/vesicle (LB/VF)، حيث يتم نقل الطبقة الدهنية السفلية من واجهة الهواء والماء من حوض لانغموير على ركيزة نظيفة، ثم ليبوسومات الصمامات إلى أعلى طبقة الدهون المدعومة وتشكيل الطبقة الثنائية النهائية39. إعادة تكوين البروتينات الغشاء باستخدام طريقة LB / VF هو أكثر مباشرة من LB / LS، كما يمكن إجراء إعادة تشكيل من خلال الانصهار من proteoliposomes. ومع ذلك، يتطلب الانصهار الحاسوس إضافة ليبوسومات زائدة، مما قد يعقد دراسة أحداث الغشاء التي تعتمد على التفاعلات البروتينية البروتينية المعتمدة على التركيز.
إعادة تشكيل ناجحة من البروتينات عبر مثقب في كل من البوليمر المربوطة ثنائية الدهون والليبوسومات في التوجه الوظيفي المفضل المهم, ولكن من الصعب إنفاذ. وهناك حاجة إلى ضوابط تجريبية لحساب هذا. بالنسبة للبوليمرات ذات طبقات الدهون المربوطة، من المهم أيضًا الحفاظ على سلامة الطبقة الدهنية الثنائية أثناء إعادة التشكيل. يجب أن تبقى تركيزات السطح منخفضة نسبيا لمنع تذويب ثنائي الدهون، ولكن عالية بما يكفي لمنع denaturation من البروتين الفائدة37،40. الطريقة الموصوفة هنا مثالية لإعادة تكوين البروتينات الغشاء لدراسات جزيء واحد ولكن ليس بالضرورة قابلة للتطوير للدراسات على نطاق أوسع. اختيار السطحي هو اعتبار مهم آخر. في كثير من الأحيان، السطحي المستخدمة لتنقية وتخزين نقطة انطلاق جيدة. التركيز الأقصى من السطحي عادة ما يكون ~200 مرات أقل من CMC36، في نطاق حيث يحافظ على استقرار البروتين ويمنع تجميع البروتين ، مع الحفاظ على سلامة الغشاء36. ويمكن النظر في الكوكتيلات التي تحتوي على 2 أو 3 مواد سطحية. لإعادة تشكيل في ليبوسومات، تركيز منخفض من السطح ليس من الضروري. ومع ذلك، فإن تركيزات السطح تحت CMC هي الأفضل للحفاظ على حجم موحد وتوزيع مورفولوجيا للليبوسومات. لمنع تسرب صبغة المحتوى ، فمن الضروري أن تطلب ضد العازلة التي تحتوي على صبغ.
على النقيض من المقايسات الانصهار القائم على الليبسومات، منصة أنشأنا يوفر نهجا للتحقيق في حركة كل خطوة من الانصهار الغشاء. توفر هذه الطريقة القدرة على دراسة بروتينات الانصهار عبر المُربَط في ظل ظروف شبه أصلية. يمكن تطبيق منصات الغشاء النموذجي لدراسة تجميع البروتين الغشائي و oligomerization ، والغشاء “النحت” ، وتفاعلات البروتينات الدهنية من البروتينات في البيئات دون الخلوية ، مثل الغشاء الداخلي الميتوكوندريا. هذه الطريقة تسمح أيضا استكشاف الظروف الفسيولوجية الهامة في التفاعل بين الغشاء والبروتين، مثل عدم التماثل تكوين ثنائي الطبقات. دور الدهون الميتوكوندريا الرئيسية, cardiolipin, في خصائص bilayer من كل من liposomes والبوليمر المدعومة bilayers لا يزال يتعين تحديدها. خصائص مثل القوة الأيونية، سمك الغشاء، صلابة الغشاء، انحناء الغشاء، وخصائص اللزوجة المرنة للغشاء قد تؤثر جميعها على قدرة البروتينات على التجمع في حالات وظيفية محددة. الدراسات المستقبلية تطبيق خلاق نظم غشاء نموذج لديها القدرة على الكشف عن جوانب جديدة من تنظيم البروتين الغشائي وظيفة.
The authors have nothing to disclose.
يعترف المؤلفون بالدعم المقدم من جائزة تشارلز ه. هود لأبحاث صحة الطفل والدعم السخي من قسم البيولوجيا الجزيئية في مستشفى ماساتشوستس العام.
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(Cyanine 5) | Avanti polar lipid | Cat #: 810335C1mg | membrane fluorescent markers |
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt) | Avanti Polar lipids | Cat #: 880130P | lipid molecules |
1',3'-bis[1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho]-glycerol (sodium salt) | Avanti Polar lipids | Cat #: 710335P | lipid molecules |
18:1 (Δ9-Cis) PC (DOPC) | Avanti Polar lipids | Cat #: 850375P | lipid molecules |
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine | Avanti Polar lipids | Cat #: 850757P | lipid molecules |
Alexa Fluor 488 Antibody Labeling Kit | ThermoFisher Scientific | A20181 | |
Amber vial with PTFE liner | Fisher scientific | 14-955-332 | sample vials to keep lipid solutions |
Calcein | Sigma-Aldrich | Cat #: C0875; PubChem Substance ID: 24892279 | fluorescent dye |
Chloroform | Fisher scientific | 298-500/ C295-4 | Fisher brand Chloroform is usually quite reliable for lipid works. |
Concavity slide (1 well) | Electron Microscopy Science | 71878-05 | applied as Schaefer Slide |
FCS analysis tool | Smith Lab, University of Akron | software tool | |
Fiji /ImageJ | Fiji | SCR_002285 | software tool |
Fisherbrand Cover Glasses: Circles | Fisher scientific | 12-545-102 | Cover glass for solid supported lipid bilayers, the item is now discontinued as authors prepared the manuscript. An alternative is Fisher brand premium cover glass with catalog number: 12-548-5M |
GTP Disodium salt | SIGMA-ALDRICH INC | Cat #: 10106399001 | |
Langmuir & Langmuir-Blodgett Trough | Biolin Scientifc | KN2002 | |
L-α-lysophosphatidylinositol (Liver, Bovine) (sodium salt) | Avanti Polar lipids | Cat #: 850091P | lipid molecules |
Mini Extruder | Avanti Polar lipids | 610020 | |
n-Dodecyl-β-D-Maltopyranoside | Anatrace | Cat #: D310 25 GM | surfactant for reconstitution |
n-Octyl-α-D-Glucopyranoside | Anatrace | Cat #: O311HA 25 GM | surfactant for reconstitution |
PC Membranes 0.2μm | Avanti Polar Lipids | 610006 | |
Rabbit Anti-Opa1 antibody | NOVUS BIOLOGICALS | Cat #: NBP2-59770 | antibody for Opa1 C-terminal detection |
Slidebook | Intelligent imaging | RRID: SCR_014300 | software tool |
Teflon threaded seal tape | Fisher Scientific | NC0636085 | taflon tape for sample storage |
Texas Red 1,2-Dihexadecanoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine, Triethylammonium Salt (Texas Red DHPE) | ThermoFisher Scientific | Cat #: T1395MP | membrane fluorescent markers |