היתוך מיטוכונדריאלי הוא תגובה הוםוסטטית חשובה הבסיסית לדינמיקה המיטוכונדריאלית. מתואר כאן היא מערכת איסוף חוץ תוך כדי לימוד היתוך מיטוכונדריאלי פנימי-קרום שיכול לפתור רצועה קרום, עגינה, המיתוך, ופתיחת נקבוביות. הרב-תכליתיות של גישה זו בחקר מערכות קרום התא נדון.
דינמיקה מיטוכונדריאלית חיונית לפונקציות המגוונות של אורגנל ולתגובות הסלולריות. קרום המיטוכונדריה הצפוף, המורכב מרחבית, הוא סביבה מאתגרת להבחין בין גורמים רגולטוריים. שליטה ניסיונית של רכיבי חלבון ושומנים יכולה לעזור לענות על שאלות ספציפיות של רגולציה. עם זאת, מניפולציה כמותית של גורמים אלה היא מאתגרת בsays תאי. כדי לחקור את המנגנון המולקולרי של היתוך המיטוכונדריה הפנימי-קרום, הצגנו פלטפורמה במבחנה מחדש המחקה את סביבת השימנים של המיטוכונדריה הפנימית קרום. כאן אנו מתארים שלבים מפורטים להכנת דו-שכבות שומנים ורכיבה מחדש של חלבוני קרום מיטוכונדריאלי. הפלטפורמה אפשרה ניתוח של ביניים בהיתוך ממברנה פנימית מיטוכונדריאלית, ואת הקינטיות עבור מעברים בודדים, באופן כמותי. פרוטוקול זה מתאר את ייצור הדו-שכבתי עם הרכב שומנים אסימטריים ומתאר שיקולים כלליים ליצירה מחדש של חלבוני טרנסמברנה לתוך דו-שכבתי מרופד. השיטה עשויה להיות מיושמת כדי ללמוד מערכות קרום אחרות.
מידול קרום הוא סימן ההיכר של תאים אאוקריוטיים1 (איור 1A). ממברנות ביולוגיות מוכרות יותר ויותר כממס דו מימדי, ונחשבות כסביבה המתפקדת כסביבה המתפקדת תפקידים קריטיים בוויסות תפקוד החלבון והרכבה מורכבתמקרומולקולרית 2,,3. שומנים ילידים הם ליגנדים לווסת את פעילות חלבון קרום3,,4. ארגון מרחבי קרום ואת היכולת של ממברנות להיות מפוסל לצורות מגוונות הם מאפיינים פיזיים חשובים לבחירת פונקציות חדשות3,5.
פלטפורמות ממברנה מודל הן מערכות ביומימטיות שיכולות לעזור לנו להבין מבנה קרום סלולרי, דינמיקה,ופונקציה 6,7,8. קרום מודל בדרך כלל מרכיב תערובת שומנים של הרכב מוגדר היטב, עם תכונות ביופיזיות מוגדרות (נוקשות, עובי, ואלסטיות). יחד עם הדמיית פלואורסץ, פלטפורמות קרום מודל לאפשר ניתוח כמותי של מבנה קרוםופונקציה 9,10,,11. אסטרטגיות תיקון דו שכבתי שומנים שימשו כדי ללמוד SNARE בתיווך קרום היתוך9,,10,היתוך קרום בתיווך DNA12,היתוך ויראלי11,13. יתרון של שיטות כאלה הוא הפוטנציאל להשיג מידע קינטי עבור שלבים ביניים לפני אירוע תגובה נצפה14.
קרום הפלזמה נחקר בהרחבה באמצעות קרום מודל. Bilayers עם הפרדת שלב שומנים פותחו כדי ללמוד מבני רפסודה שומניםחשובים איתות סלולרי 11,15,16. מיקרופטרן שומנים בשכבות17,18 שימשו כדי לחקור את הארגון של קולטני תא. ממברנות פולימר או ג’ל נתמך שימשו כמערכות ביומימטיות כדי ללמוד את ארגון קרום-cytoskeleton, חלוקת חלבון קרום במהלך איתות תא, והגירה במגעים תא19.
מערכות קרום מלאכותי מוחלים גם ללמוד organelles תתתאיים 20. אורגנלים כוללים מורפולוגיות אופייניות שיוצרות סביבות משנה נפרדות. רשת הרשתית האנדופלסמית (ER) היא דוגמה אחת. עם restitutions של reticulons לתוך ליפוסומים, מבנים צינורית קרום עם מאפיינים דומים ER התאנוצרים 21. התוספת של אטלסטין, חלבון היתוך ER, יכול לגרום צינורות שומנים מליפוזומים כדי ליצור רשת20. זוהי דוגמה אחת לאופן שבו פרוטאוליפוזומים יכולים לספק תובנה פונקציונלית על מורפולוגיה ודינמיקה של אורגנל.
היתוך קרום מיטוכונדריאלי וביעוש חיוניים לבריאות האוכלוסייה המיטוכונדריאלית22,23,,24,,25. סט של משפחת דינמין GTPases מקטליזה מיטוכונדריה קרום היתוך. Mfn 1/2 קתליזה היתוך קרום חוץ. Opa1 מתווכת היתוך פנימי-קרום26 (איור 1B). Opa1 יש שתי צורות: צורה ארוכה (l-Opa1), transmembrane מעוגן ממברנה הפנימית המיטוכונדריאלי, וצורה קצרה ‘מסיסה’ (s-Opa1), נוכח בחלל intermembrane. היחס בין שני טפסי Opa1 מוסדר על ידי הפעילות של שני פרוטאזים, Oma1 ו Yme1L27,28,29,30. שאלות חשובות ברגולציה Opa1 כוללות: כיצד שתי הצורות של Opa1, (קצר וארוך) לתווך היתוך קרום ו שלהםיחסי הגומלין הרגולטוריים שלהם 28,29,31,32,33.
כאן אנו מתארים אסטרטגיית איסוף מחדש שהוחלה בהצלחה כדי לחקור היתוך מיטוכונדריאלי פנימי-קרום שהבהיר את התפקידים של l- ו s-Opa1 בהיתוך ממברנה פנימית. פיתחנו פלטפורמה המחקה את המיטוכונדריה הפנימית-קרום באמצעות דוטל שומנים קשור פולימר ו 200 צפון צפון שלל unilamellar. היתרונות של רצועה פולימרית מתחת לקוטל הליפידים כוללים את הדברים הבאים. ראשית, הוא משמר את חלבון הטרנסמברנה המשוחזר, שאחרת היה עלול להיות משובש על ידי הקרבה לשקופית הזכוכית34. שנית, הוא משמש שכבת מים עבה בין ביטל השומנים ומצוע זכוכית, אשר מקל על מחקריםשל פתיחת נקבוביות 9, ושלישית את האופי צמיג של פולימר PEG מאפשר שינויים עקמומיות קרום35. השתמשנו בהדמיית פלואורסץ של שלושה צבעים כדי לאפיין שלבים בהיתוך קרום(איור 1C-F).
איור 1: ניטור היתוך קרום מיטוכונדריאלי.
אורגנליםהם תאי קרום תאיים. (ב)שלבים רצים של היתוך קרום מיטוכונדריאלי. היתוך של הממברנה ההחוצה של המיטוכונדריה הוא זן על ידי Mfn1 ו / או Mfn2, בעוד היתוך ממברנה פנימית הוא בתיווך Opa1. אני לאיודע מה לעשות. סכמטי של פלטפורמת ההשבתה במבחנה כדי ללמוד היתוך קרום מיטוכונדריאלי. הפלטפורמה כוללת שני חלקים: פרוטאוליפוזה ובלם שומנים קשור פולימר, שניהם עם l-Opa1 משוחזר. תוויות פלורסנט, כולל שני צבעי קרום פלורסנט שונים וסמן תוכן, מסייעים להבחין בין שלבים במהלך היתוך קרום. שני סמני קרום (Cy5-PE (אדום) ו TexasRed PE (כתום) לעשות זוג FRET, אשר יכול לדווח על עגינת קרום קרוב. דיפוזיה של TexasRed-PE כי תוויות proteoliposome הוא אינדיקטור של demixing שומנים (המיפוזיה). שחרור תוכן מנוטר באמצעות ההתללות של אות הקלצ’ין (מוצג בירוק). לוחות A ו- B נוצרו באמצעות Biorender. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.
במערכות ממברנה מודל המבחנה יכול לתאר תהליכי קרום מורכבים בתנאים מוגדרים היטב. מערכות אלה יכולות להבחין בין רכיבים מינימליים הנחוצים לתהליכים מולקולריים מורכביםכדי לחשוף מנגנוניםמולקולריים 6 , 15,,20,,38., עבור חלבוני קרום, ליפוסומים וbilayers נתמך פלנר הם מערכות reconstitution נפוצות. בניגוד לשומנים דו-שכבות הנתמכים על-ידי מוצק, כרית הפולימר בין המצוע לבין קרום נתמך בשכבות פולימריות קשורות מאפשרת ניידות חופשית של חלבוני קרום גדולים, וחלבונים טרנסמברנה כדי לפזר ולהרכיבבחופשיות 34. תכונות אלה עזרו לנו לחקור את הקינטיות של המיטוכונדריה היתוך פנימי-קרום36.
הכנו דו-שכבת שומנים פולימרית קשורה באמצעות טכניקות לנגמיר-בלודג’ט/לנגמיר-שייפר (LB/LS). זה מאפשר לנו להכין דו-שכבתי עם רכיבי שומנים אסימטריים. קרום תאי יש הרכב עלון אסימטרי, ואת הגישה LB / LS מאפשר את המחקר של bilayers כאלה. עם העברת שייפר, ניתן לכסות את המקום שלם על ידי דו-שכבת שומנים. זה קריטי להכין משטח נקי להכנת דו-שכבתי. בנוסף, נדרש אימון כדי לבצע העברת שייפר כראוי. העברת שייפר לא מוצלחת יכולה ליצור פגמים לא רצויים ברכיבה על שומנים. בפרוטוקול זה, הלחץ שנוסף לאיזון הסרט ישים עבור דו-שכבתי המכיל 20% קרדיוליפין. עבור bilayers עם רכיבים אחרים, עיין באזור הלחץ של פני השטח isotherm של רכיבי המפתח. שיטה חלופית היא שיטת ההיתוך Langmuir-Blodgett/vesicle (LB/VF), שבה המונו-שכבת השימנים התחתונה מועברת מממשק מי האוויר של שוקת לנגמיר אל המצע הנקי, ואז ליפוזומים מתמזגים לראש המונואלייטר השימנים הנתמך ויוצריםאת הדו-שכבתי הסופי 39. איסוף מחדש של חלבוני ממברנה באמצעות שיטת LB/VF הוא פשוט יותר מאשר LB / LS, כמו reconstitution ניתן לבצע באמצעות ההיתוך של פרוטאוליפוזומים. עם זאת, היתוך של שלבקת דורש תוספת של ליפוזומים עודפים, אשר עשוי לסבך את המחקר של אירועי קרום תלויים אינטראקציות תלויות חלבון-חלבון תלויריכוז.
ההשבתה המוצלחת של חלבוני טרנסמברנה לתוך שתי שכבות שומנים קשורפולימר ולליפוזומים באוריינטציה פונקציונלית מועדפת היא חשובה, אך קשה לאכוף. יש צורך בבקרות ניסיוניות כדי להסביר זאת. עבור פולימר קשור שומנים דו-שכבתיים, חשוב גם לשמור על שלמות של דו-שכבת שומנים במהלך reconstitution. ריכוזי פעילי שטח חייבים להיות נמוכים יחסית כדי למנוע המסת דו-שכבת השומנים, אבל גבוה מספיק כדי למנוע פירוק של חלבוןשל עניין 37,40. השיטה המתוארת כאן היא אידיאלית עבור שחזור חלבוני קרום עבור מחקרים מולקולה אחת, אבל הוא לא בהכרח מדרגי עבור מחקרים בקנה מידה גדול יותר. בחירת פעילי שטח היא שיקול חשוב נוסף. לעתים קרובות, פעילי שטח המשמשים לטיהור ואחסון היא נקודת התחלה טובה. הריכוז המרבי של פעילי שטח הוא בדרך כלל ~ 200 פעמים פחות של CMC36, בטווח שבו פעילי שטח שומר על יציבות חלבון ומונע צבירת חלבונים, תוך שמירה על שלמותקרום 36. קוקטיילים המכילים 2 או 3 פעילי שטח עשויים להיחשב. עבור reconstitution לתוך ליפוזומים, ריכוז נמוך של פעילי שטח אינו הכרחי. עם זאת, ריכוזי פעילי שטח מתחת CMC עדיפים לשמור על גודל אחיד והפצה מורפולוגיה עבור ליפוזומים. כדי למנוע דליפה של צבע תוכן, יש צורך בחיוג מול מאגר המכיל צבע.
בניגוד לתכני היתוך מבוססי ליפוזום, הפלטפורמה שהקמנו מספקת גישה לחקור את הקינטיים של כל שלב של היתוך קרום. שיטה זו מספקת את היכולת ללמוד חלבוני היתוך transmembrane בתנאים כמעט מקומיים. פלטפורמות ממברנה מודל ניתן להחיל ללמוד הרכבת חלבון קרום ואוליגומריזציה, קרום “פיסול”, ואינטראקציות חלבון-שומנים של חלבונים בסביבות תת תאיות, כמו המיטוכונדריה הפנימית קרום. שיטה זו מאפשרת גם לחקור מצבים פיזיולוגיים חשובים באינטרפליי קרום-חלבון, כגון אסימטריה הרכב דו שכבתי. התפקיד של שומנים מיטוכונדריאליים מפתח, cardiolipin, במאפיינים דו שכבתי של שתי ליפונים וbilayers הנתמכים פולימר נשאר להיות מוגדר. מאפיינים כגון הכוח היוני, עובי קרום, נוקשות קרום, עקמומיות קרום, ומאפייני צמיגות אלסטית קרום כל עשוי להשפיע על היכולת של חלבונים כדי הרכבה למצבים פונקציונליים ספציפיים. מחקרים עתידיים החלת מערכות קרום מודל באופן יצירתי יש פוטנציאל לחשוף היבטים חדשים של ארגון חלבון קרום ותפקוד.
The authors have nothing to disclose.
המחברים מכירים בתמיכה של פרס מחקר בריאות הילד של קרן צ’ארלס הוד ותמיכה נדיבה מהמחלקה לביולוגיה מולקולרית בבית החולים הכללי של מסצ’וסטס.
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(Cyanine 5) | Avanti polar lipid | Cat #: 810335C1mg | membrane fluorescent markers |
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt) | Avanti Polar lipids | Cat #: 880130P | lipid molecules |
1',3'-bis[1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho]-glycerol (sodium salt) | Avanti Polar lipids | Cat #: 710335P | lipid molecules |
18:1 (Δ9-Cis) PC (DOPC) | Avanti Polar lipids | Cat #: 850375P | lipid molecules |
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine | Avanti Polar lipids | Cat #: 850757P | lipid molecules |
Alexa Fluor 488 Antibody Labeling Kit | ThermoFisher Scientific | A20181 | |
Amber vial with PTFE liner | Fisher scientific | 14-955-332 | sample vials to keep lipid solutions |
Calcein | Sigma-Aldrich | Cat #: C0875; PubChem Substance ID: 24892279 | fluorescent dye |
Chloroform | Fisher scientific | 298-500/ C295-4 | Fisher brand Chloroform is usually quite reliable for lipid works. |
Concavity slide (1 well) | Electron Microscopy Science | 71878-05 | applied as Schaefer Slide |
FCS analysis tool | Smith Lab, University of Akron | software tool | |
Fiji /ImageJ | Fiji | SCR_002285 | software tool |
Fisherbrand Cover Glasses: Circles | Fisher scientific | 12-545-102 | Cover glass for solid supported lipid bilayers, the item is now discontinued as authors prepared the manuscript. An alternative is Fisher brand premium cover glass with catalog number: 12-548-5M |
GTP Disodium salt | SIGMA-ALDRICH INC | Cat #: 10106399001 | |
Langmuir & Langmuir-Blodgett Trough | Biolin Scientifc | KN2002 | |
L-α-lysophosphatidylinositol (Liver, Bovine) (sodium salt) | Avanti Polar lipids | Cat #: 850091P | lipid molecules |
Mini Extruder | Avanti Polar lipids | 610020 | |
n-Dodecyl-β-D-Maltopyranoside | Anatrace | Cat #: D310 25 GM | surfactant for reconstitution |
n-Octyl-α-D-Glucopyranoside | Anatrace | Cat #: O311HA 25 GM | surfactant for reconstitution |
PC Membranes 0.2μm | Avanti Polar Lipids | 610006 | |
Rabbit Anti-Opa1 antibody | NOVUS BIOLOGICALS | Cat #: NBP2-59770 | antibody for Opa1 C-terminal detection |
Slidebook | Intelligent imaging | RRID: SCR_014300 | software tool |
Teflon threaded seal tape | Fisher Scientific | NC0636085 | taflon tape for sample storage |
Texas Red 1,2-Dihexadecanoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine, Triethylammonium Salt (Texas Red DHPE) | ThermoFisher Scientific | Cat #: T1395MP | membrane fluorescent markers |