Mitochondriale fusie is een belangrijke homeostatische reactie die ten grondslag ligt aan mitochondriale dynamiek. Hier beschreven is een in vitro reconstitution systeem om mitochondriale binnenmembraan fusie die membraan tethering, docking, hemifusion, en porie opening kan oplossen. De veelzijdigheid van deze aanpak bij het verkennen van celmembraansystemen wordt besproken.
Mitochondriale dynamiek is essentieel voor de diverse functies en cellulaire reacties van de organelle. Het overvolle, ruimtelijk complexe, mitochondriale membraan is een uitdagende omgeving om regelgevende factoren te onderscheiden. Experimentele controle van eiwit- en lipidecomponenten kan helpen bij het beantwoorden van specifieke reguleringsvragen. Toch is kwantitatieve manipulatie van deze factoren een uitdaging in cellulaire testen. Om het moleculaire mechanisme van mitochondriën binnenmembraanfusie te onderzoeken, introduceerden we een in vitro reconstitution platform dat de lipide omgeving van het mitochondriale binnenmembraan nabootst. Hier beschrijven we gedetailleerde stappen voor het voorbereiden van lipide bilayers en het reconstrueren van mitochondriale membraaneiwitten. Het platform stond analyse van tussenproducten in mitochondriale binnenmembraanfusie en de kinetiek voor individuele overgangen toe, op een kwantitatieve manier. Dit protocol beschrijft de fabricage van bilayers met asymmetrische lipide samenstelling en beschrijft algemene overwegingen voor het reconstrueren van transmembrane eiwitten in een gedempte bilayer. De methode kan worden toegepast om andere membraansystemen te bestuderen.
Membraancompartimentering is een kenmerk van eukaryotische cellen1 (figuur 1A). Biologische membranen worden steeds meer erkend als meer dan een tweedimensionaal oplosmiddel en worden beschouwd als een omgeving die een cruciale rol speelt bij het reguleren van de eiwitfunctie en het macromoleculaire complex assemblage2,3. Inheemse lipiden zijn liganden die membraaneiwitactiviteit3,4reguleren. Membraan ruimtelijke organisatie en het vermogen van membranen te worden gebeeldhouwd in diverse vormen zijn belangrijke fysieke eigenschappen voor het selecteren van nieuwe functies3,5.
Modelmembraanplatforms zijn biomimetische systemen die ons kunnen helpen de structuur, dynamiek en,functie6,7,8te begrijpen. Modelmembranen bestaan meestal uit een lipidemengsel van goed gedefinieerde samenstelling, met gedefinieerde biofysische eigenschappen (stijfheid, dikte en elasticiteit). In combinatie met fluorescentiebeeldvorming maken modelmembraanplatforms kwantitatieve analyse van de membraanstructuur en functie9,10,11mogelijk . Lipide bilayer reconstitutie strategieën zijn gebruikt om SNARE-gemedieerde membraan fusie9,10, DNA-gemedieerde membraan fusie12, en virale fusie11,13te bestuderen . Een voordeel van dergelijke methoden is het potentieel om kinetische informatie te verkrijgen voor tussenstappen voorafgaand aan een waarneembare reactiegebeurtenis14.
Het plasmamembraan is uitgebreid bestudeerd met behulp van modelmembranen. Bilayers met lipide fase scheiding zijn ontwikkeld om lipide vlot structuren belangrijk in cellulaire signalering11,15,16studie . Micropatterned lipide planaire bilayers17,18 zijn gebruikt om de organisatie van celreceptoren te onderzoeken. Polymeer of gel-ondersteunde membranen zijn gebruikt als biomimetische systemen om de membraan-cytoskelet organisatie, membraan eiwit partitionering tijdens celsignalering, en migratie bij cel-cel contacten19te bestuderen.
Kunstmatige membraansystemen worden ook toegepast om subcellulaire organellen te bestuderen20. Organelles hebben karakteristieke morfologieën die verschillende subomgevingen creëren. Het endoplasmatische reticulum (ER) netwerk is daar een voorbeeld van. Bij de reconstructie van reticulons in liposomen worden buisvormige membraanstructuren met eigenschappen die vergelijkbaar zijn met de cellulaire ER gevormd21. De toevoeging van atlastine, een ER fusion eiwit, kan lipide tubuli uit liposomen opwekken om een netwerk20te vormen. Dit is een voorbeeld voor hoe proteoliposomes functioneel inzicht kunnen geven in organellemorfologie en dynamiek.
Mitochondriale membraanfusie en splijting zijn essentieel voor de gezondheid van de mitochondriale bevolking22,23,24,25. Een set van dynamin familie GTPases katalyseert mitochondriën membraan fusie. Mfn 1/2 katalyseert buitenste membraanfusie. Opa1 bemiddelt binnenmembraanfusie26 (figuur 1B). Opa1 heeft twee vormen: een lange vorm (l-Opa1), transmembrane verankerd aan het mitochondriale binnenmembraan, en een ‘oplosbare’ korte vorm (s-Opa1), aanwezig in de intermembrane ruimte. De verhouding tussen de twee Opa1-formulieren wordt geregeld door de activiteit van twee proteasen, Oma1 en Yme1L27,28,29,30. Belangrijke vragen in de Opa1-verordening zijn onder meer: hoe de twee vormen van Opa1 , (korte en lange) bemiddelende membraanfusie en hun regelgevende samenspel28,29,31,32,33.
Hier beschrijven we een reconstitution strategie die met succes werd toegepast om mitochondriale binnenmembraanfusie te onderzoeken die de rol van l- en s-Opa1 in binnenmembraanfusie verduidelijkte. We ontwikkelden een platform dat het mitochondriale binnenmembraan nabootste met behulp van een polymeer-gebonden lipidebilayer en 200 nm unilamellar vluimen. De voordelen van een polymeer ketting onder de lipide bilayer omvatten de volgende. Ten eerste behoudt het het gereconstitueerde transmembrane-eiwit, dat anders zou kunnen worden verstoord door de nabijheid van de glazen schuif34. Ten tweede dient het een dikke waterlaag tussen de lipide bilayer en glassubstraat, die studies van porie opening9vergemakkelijkt , en ten derde de visco-elastische aard van de PEG polymeer maakt membraan kromming veranderingen35. We gebruikten driekleurige fluorescentiebeeldvorming om stappen in membraanfusie te karakteriseren(figuur 1C-F).
Figuur 1: Monitoring mitochondriale membraanfusie.
(A) Organellen zijn cellulaire membraancompartimenten. (B) Sequentiële stappen van mitochondriale membraanfusie. Fusie van het buitenste membraan van mitochondriën wordt gekatalyseerd door Mfn1 en/of Mfn2, terwijl binnenmembraanfusie wordt bemiddeld door Opa1. (C-F) Schematisch van het in vitro reconstitution platform om mitochondriale membraanfusie te bestuderen. Het platform bestaat uit twee delen: een proteolisome en een polymeer-vastgebonden lipide bilayer, beide met gereconstitueerde l-Opa1. Fluorescerende etiketten, waaronder twee verschillende fluorescerende membraankleurstoffen en een inhoudsmarkering, helpen stappen te onderscheiden tijdens membraanfusie. De twee membraanmarkeringen (Cy5-PE (rood) en TexasRed PE (oranje) maken een FRET-paar, dat kan rapporteren over close membrane docking. Diffusie van TexasRed-PE dat etiketten proteoliposome is een indicator van lipide demixing (hemifusion). Content release wordt gecontroleerd door het dequenching van het calcein signaal (weergegeven in het groen). Panelen A en B gemaakt met biorender. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
In vitro model-membraansystemen kunnen complexe membraanprocessen beschrijven onder welomschreven omstandigheden. Deze systemen kunnen minimale componenten onderscheiden die nodig zijn voor complexe moleculaire processen om moleculaire mechanismen6,15,20,38te onthullen . Voor membraaneiwitten zijn liposomen en vlakke ondersteunde bilayers veelvoorkomende reconstitutiesystemen. In tegenstelling tot solide ondersteunde lipidebilayers, maakt het polymeerkussen tussen het substraat en het ondersteunde membraan in polymeer-gebonden tweelagen vrije mobiliteit van grote membraaneiwitten mogelijk, en transmembranen-eiwitten om vrij te verspreiden en te assembleren34. Deze kenmerken hielpen ons bij het onderzoeken van de kinetiek van mitochondriën innermembraan fusie36.
We hebben een polymeer-gebonden lipide bilayer bereid met langmuir-Blodgett/Langmuir-Schaefer (LB/LS) technieken. Dit stelt ons in staat om een bilayer met asymmetrische lipide componenten voor te bereiden. Cellulaire membranen hebben asymmetrische bijsluitersamenstelling, en de LB / LS-aanpak maakt de studie van dergelijke bilayers. Met Schaefer-overdracht kan een volledig glazen substraat worden afgedekt door een lipidebilayer. Het is van cruciaal belang om een schoon oppervlak voor te bereiden voor de voorbereiding van de tweelaags. Daarnaast is de praktijk nodig om een Schaefer-overdracht correct uit te voeren. Mislukte Schaefer overdracht kan leiden tot ongewenste gebreken in een lipide bilayer. In dit protocol is de druk die wordt toegevoegd aan de filmbalans van toepassing op een bilayer met 20% cardiolipin. Voor bilayers met andere componenten, verwijzen naar het oppervlak druk-gebied isotherm van de belangrijkste componenten. Een alternatieve methode is de Langmuir-Blodgett/vesicle fusion (LB/VF) methode, waarbij de onderste lipide monolayer wordt overgebracht van de luchtwaterinterface van een Langmuir-trog op een schoon substraat, dan fusemen liposomen naar de bovenkant van de ondersteunde lipidemonolaag en de uiteindelijke bilayer39vormen. Reconstitutie van membraaneiwitten met behulp van de LB/VF-methode is eenvoudiger dan LB/LS, omdat reconstitutie kan worden uitgevoerd door de fusie van proteoliposomen. Echter, vesicle fusie vereist de toevoeging van overtollige liposomen, die de studie van membraan gebeurtenissen afhankelijk van concentratie-afhankelijke eiwit-eiwit interacties kan bemoeilijken.
De succesvolle reconstructie van transmembrane eiwitten in zowel polymeer-vastgebonden lipide bilayers en liposomen in een voorkeur functionele oriëntatie is belangrijk, maar moeilijk af te dwingen. Hiervoor zijn experimentele controles nodig. Voor polymeer-gebonden lipide bilayers, is het ook belangrijk om de integriteit van lipide bilayer tijdens de reconstitutie te behouden. Oppervlakteactieve concentraties moeten relatief laag worden gehouden om te voorkomen dat de lipide bilayer wordt opgelost, maar hoog genoeg om denaturatie van het eiwit van belang37,40te voorkomen . De hier beschreven methode is ideaal voor het reconstrueren van membraaneiwitten voor studies met één molecuul, maar is niet noodzakelijkerwijs schaalbaar voor grootschaligere studies. Surfactant keuze is een andere belangrijke overweging. Vaak is de oppervlakteactieve stoffen die worden gebruikt voor zuivering en opslag een goed uitgangspunt. De maximale concentratie van oppervlakteactieve stoffen is meestal ~200 keer minder van de CMC36, in een bereik waar de oppervlakteactieve stoffen eiwitstabiliteit behoudt en eiwitaggregatie voorkomt, met behoud van de integriteit van membraan36. Cocktails met 2 of 3 oppervlakteactieve stoffen kunnen in aanmerking worden genomen. Voor reconstitutie in liposomen is een lage concentratie oppervlakteactieve stoffen niet nodig. Oppervlakteactieve concentraties onder CMC hebben echter de voorkeur om een uniforme grootte en morfologieverdeling voor de liposomen te behouden. Om lekkage van inhoudskleurstof te voorkomen, is het noodzakelijk om te dialyseren tegen een kleurstofhoudende buffer.
In tegenstelling tot liposoom-gebaseerde fusietesten, biedt het platform dat we hebben opgezet een aanpak om de kinetiek van elke stap van membraanfusie te onderzoeken. Deze methode biedt de mogelijkheid om transmembrane fusie-eiwitten te bestuderen onder bijna-inheemse omstandigheden. Modelmembraanplatforms kunnen worden toegepast om membraaneiwitassemblage en oligomerisatie, membraan “beeldhouwen” en eiwitlipide interacties van eiwitten in subcellulaire omgevingen te bestuderen, zoals het mitochondriale binnenmembraan. Deze methode maakt het ook mogelijk om belangrijke fysiologische omstandigheden in het membraan-eiwit samenspel te verkennen, zoals bilayer samenstelling asymmetrie. De rol van een belangrijke mitochondriale lipide, cardiolipine, in de bilayer-eigenschappen van zowel liposomen als polymeerondersteunde bilayers moet nog worden gedefinieerd. Eigenschappen zoals de ionische sterkte, membraandikte, membraanstijfheid, membraankromming en membraan-viscositeit eigenschappen kunnen allemaal invloed hebben op het vermogen van eiwitten om te assembleren in specifieke functionele toestanden. Toekomstige studies creatief toepassen modelmembraan systemen hebben potentieel om nieuwe aspecten van membraan eiwit organisatie en functie te ontdekken.
The authors have nothing to disclose.
De auteurs erkennen de steun van Charles H. Hood Foundation Child Health Research Award en genereuze steun van het Department of Molecular Biology in het Massachusetts General Hospital.
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(Cyanine 5) | Avanti polar lipid | Cat #: 810335C1mg | membrane fluorescent markers |
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt) | Avanti Polar lipids | Cat #: 880130P | lipid molecules |
1',3'-bis[1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho]-glycerol (sodium salt) | Avanti Polar lipids | Cat #: 710335P | lipid molecules |
18:1 (Δ9-Cis) PC (DOPC) | Avanti Polar lipids | Cat #: 850375P | lipid molecules |
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine | Avanti Polar lipids | Cat #: 850757P | lipid molecules |
Alexa Fluor 488 Antibody Labeling Kit | ThermoFisher Scientific | A20181 | |
Amber vial with PTFE liner | Fisher scientific | 14-955-332 | sample vials to keep lipid solutions |
Calcein | Sigma-Aldrich | Cat #: C0875; PubChem Substance ID: 24892279 | fluorescent dye |
Chloroform | Fisher scientific | 298-500/ C295-4 | Fisher brand Chloroform is usually quite reliable for lipid works. |
Concavity slide (1 well) | Electron Microscopy Science | 71878-05 | applied as Schaefer Slide |
FCS analysis tool | Smith Lab, University of Akron | software tool | |
Fiji /ImageJ | Fiji | SCR_002285 | software tool |
Fisherbrand Cover Glasses: Circles | Fisher scientific | 12-545-102 | Cover glass for solid supported lipid bilayers, the item is now discontinued as authors prepared the manuscript. An alternative is Fisher brand premium cover glass with catalog number: 12-548-5M |
GTP Disodium salt | SIGMA-ALDRICH INC | Cat #: 10106399001 | |
Langmuir & Langmuir-Blodgett Trough | Biolin Scientifc | KN2002 | |
L-α-lysophosphatidylinositol (Liver, Bovine) (sodium salt) | Avanti Polar lipids | Cat #: 850091P | lipid molecules |
Mini Extruder | Avanti Polar lipids | 610020 | |
n-Dodecyl-β-D-Maltopyranoside | Anatrace | Cat #: D310 25 GM | surfactant for reconstitution |
n-Octyl-α-D-Glucopyranoside | Anatrace | Cat #: O311HA 25 GM | surfactant for reconstitution |
PC Membranes 0.2μm | Avanti Polar Lipids | 610006 | |
Rabbit Anti-Opa1 antibody | NOVUS BIOLOGICALS | Cat #: NBP2-59770 | antibody for Opa1 C-terminal detection |
Slidebook | Intelligent imaging | RRID: SCR_014300 | software tool |
Teflon threaded seal tape | Fisher Scientific | NC0636085 | taflon tape for sample storage |
Texas Red 1,2-Dihexadecanoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine, Triethylammonium Salt (Texas Red DHPE) | ThermoFisher Scientific | Cat #: T1395MP | membrane fluorescent markers |