La fusion mitochondriale est une réaction homéostatique importante sous-jacente à la dynamique mitochondriale. Décrit ici est un système de reconstitution in vitro pour étudier la fusion mitochondriale de membrane interne qui peut résoudre l’attachement de membrane, l’amarrage, l’hémifusion, et l’ouverture de pore. La polyvalence de cette approche dans l’exploration des systèmes de membrane cellulaire est discutée.
La dynamique mitochondriale est essentielle pour les diverses fonctions et réponses cellulaires de l’organelle. La membrane mitochondriale surpeuplée, complexe spatialement, est un environnement difficile pour distinguer les facteurs régulateurs. Le contrôle expérimental des composants protéiques et lipidiques peut aider à répondre à des questions spécifiques de régulation. Pourtant, la manipulation quantitative de ces facteurs est difficile dans les tests cellulaires. Pour étudier le mécanisme moléculaire de la fusion des mitochondries à membrane interne, nous avons introduit une plate-forme de reconstitution in vitro qui imite l’environnement lipidique de la membrane interne mitochondriale. Ici, nous décrivons des étapes détaillées pour préparer les bicouches lipidiques et reconstituer les protéines membranaires mitochondriales. La plate-forme a permis l’analyse des intermédiaires dans la fusion mitochondriale de membrane interne, et la cinétique pour les transitions individuelles, d’une manière quantitative. Ce protocole décrit la fabrication de bicouches à composition lipidique asymétrique et décrit des considérations générales pour reconstituer les protéines transmembranaires en bilayer amorti. La méthode peut être appliquée pour étudier d’autres systèmes membranaires.
La compartimentation membranaire est une caractéristique des cellules eucaryotes1 (Figure 1A). Les membranes biologiques sont de plus en plus reconnues comme plus qu’un solvant bidimensionnel, et sont considérées comme un environnement jouant un rôle essentiel dans la régulation de la fonction protéique et de l’assemblage complexe macromoléculaire2,3. Les lipides indigènes sont des ligands qui régulent l’activité protéique membranaire3,4. L’organisation spatiale de membrane et la capacité des membranes à être sculptées dans diverses formes sont des propriétés physiques importantes pour sélectionner de nouvelles fonctions3,5.
Les plates-formes de membrane de modèle sont des systèmes biomimétiques qui peuvent nous aider à comprendre la structure, la dynamique et la fonction de membrane cellulaire6,7,8. Les membranes modèles comprennent généralement un mélange lipidique de composition bien définie, avec des propriétés biophysiques définies (rigidité, épaisseur et élasticité). Couplées à l’imagerie par fluorescence, les plates-formes membranaires modèles permettent l’analyse quantitative de la structure et de la fonction de la membrane9,,10,11. Les stratégies de reconstitution de bilayer lipidique ont été utilisées pour étudier la fusion membranaire snare-médiée9,10, fusion membranaire à médiation d’ADN12, et fusion virale11,13. Un avantage de ces méthodes est la possibilité d’obtenir des informations cinétiques pour les étapes intermédiaires précédant un événement de réaction observable14.
La membrane plasmatique a fait l’objet d’études approfondies à l’aide de membranes modèles. Des bicouches avec séparation de phase lipidique ont été développées pour étudier les structures de radeau lipidique importantes dans la signalisation cellulaire11,15,16. Les bilayers planaires de lipides micropatternés17,18 ont été utilisés pour étudier l’organisation des récepteurs cellulaires. Des membranes de polymère ou de gel ont été utilisées comme systèmes biomimétiques pour étudier l’organisation membranaire-cytosquelette, le partitionnement des protéines membranaires pendant la signalisation cellulaire, et la migration aux contacts cellule-cellule19.
Des systèmes de membrane artificielle sont également appliqués pour étudier les organites subcellulaires20. Les organites présentent des morphologies caractéristiques qui créent des sous-environnements distincts. Le réseau réticulum endoplasmique (ER) en est un exemple. Lors de la reconstitution des réticulons en liposomes, les structures tubulaires de membrane avec des propriétés semblables à l’ER cellulaire sont formées21. L’ajout d’atlastine, une protéine de fusion ER, peut induire des tubules lipidiques à partir de liposomes pour former un réseau20. C’est un exemple pour la façon dont les protéoliposomes peuvent fournir un aperçu fonctionnel de la morphologie et de la dynamique organielles.
La fusion et la fission des membranes mitochondriales sont essentielles pour la santé de la population mitochondriale22,23,24,25. Un ensemble de dynamimine famille GTPases catalyse la fusion memitochondrial membranaire. Mfn 1/2 catalyse la fusion de membrane externe. Opa1 médiateur la fusion à membrane interne26 (Figure 1B). Opa1 a deux formes : une forme longue (l-Opa1), la transmembrane ancrée à la membrane interne mitochondriale, et une forme courte « soluble » (s-Opa1), présente dans l’espace intermembrane. Le rapport des deux formulaires Opa1 est réglementé par l’activité de deux protéases, Oma1 et Yme1L27,28,29,30. Les questions importantes dans la réglementation Opa1 comprennent: comment les deux formes de fusion de membrane de médiation Opa1, (courte et longue) et leur interaction réglementaire28,29,31,32,33.
Ici nous décrivons une stratégie de reconstitution appliquée avec succès pour étudier la fusion mitochondriale de membrane interne qui a clarifié les rôles de l- et s-Opa1 dans la fusion interne-membrane. Nous avons développé une plate-forme imitant la membrane interne mitochondriale à l’aide d’une bicouche lipidique liée au polymère et de vésicules unilamellar de 200 nm. Les avantages d’une attache de polymère sous la bicouche lipidique incluent les éléments suivants. Tout d’abord, il préserve la protéine transmembrane reconstituée, qui autrement pourrait être perturbée par la proximité de la lame de verre34. Deuxièmement, il sert une épaisse couche d’eau entre la bicouche lipidique et le substrat en verre, ce qui facilite les études de l’ouverture des pores9, et troisièmement la nature viscoélastique du polymère PEG permet des changements de courbure membranaire35. Nous avons utilisé l’imagerie par fluorescence tricolore pour caractériser les étapes de la fusion membranaire (Figure 1C-F).
Figure 1 : Surveillance de la fusion des membranes mitochondriales.
(A) Les Organites sont des compartiments à membrane cellulaire. (B) Étapes séquentielles de la fusion de membrane mitochondriale. La fusion de la membrane externe des mitochondries est catalysée par Mfn1 et/ou Mfn2, tandis que la fusion des membranes intérieures est médiée par Opa1. (C-F) Schéma de la plate-forme de reconstitution in vitro pour étudier la fusion memitolière membranaire. La plate-forme comprend deux parties : un protéoliposome et une bicouche lipidique à attache polymère, toutes deux avec l-Opa1 reconstituée. Les étiquettes fluorescentes, y compris deux colorants fluorescents à membrane différents et un marqueur de contenu, aident à distinguer les étapes lors de la fusion des membranes. Les deux marqueurs membranaires (Cy5-PE (rouge) et TexasRed PE (orange) font une paire FRET, qui peut se rapporter sur l’amarrage à membrane étroite. Diffusion de TexasRed-PE qui étiquette protéoliposome est un indicateur de démélangage lipidique (hémifusion). La libération de contenu est surveillée par le déquenchage du signal de calcéine (montré en vert). Panneaux A et B créés à l’aide de Biorender. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Les systèmes in vitro de membrane modèle peuvent décrire des processus de membrane complexes dans des conditions bien définies. Ces systèmes peuvent distinguer les composants minimaux nécessaires à des processus moléculaires complexes pour révéler les mécanismes moléculaires6,15,20,38. Pour les protéines membranaires, les liposomes et les bilayers supportés par planar sont des systèmes de reconstitution courants. Contrairement aux bicouches lipidiques soutenues solidement, le coussin polymère entre le substrat et la membrane soutenue dans les bicouches à attaches polymères permet une libre mobilité des grandes protéines membranaires, et les protéines transmembranantes de diffuser et d’assembler librement34. Ces caractéristiques nous ont aidés à étudier la cinétique des mitochondries fusion de membrane interne36.
Nous avons préparé un bicouche lipidique attaché au polymère à l’aide des techniques Langmuir-Blodgett/Langmuir-Schaefer (LB/LS). Cela nous permet de préparer une bicouche avec des composants lipidiques asymétriques. Les membranes cellulaires ont une composition de feuillet asymétrique, et l’approche LB/LS permet l’étude de ces bicouches. Avec le transfert schaefer, un substrat en verre entier peut être recouvert d’une bicouche lipidique. Il est essentiel de préparer une surface propre pour la préparation des bicouches. En outre, il faut de la pratique pour effectuer un transfert Schaefer correctement. Le transfert infructueux de Schaefer peut créer des défauts indésirables dans une bicouche lipidique. Dans ce protocole, la pression ajoutée à l’équilibre du film s’applique à une bicouche contenant 20% de cardiolipine. Pour les bicouches avec d’autres composants, reportez-vous à l’isotherme de la surface de la zone de pression des composants clés. Une méthode alternative est la méthode Langmuir-Blodgett/vesicle fusion (LB/VF), où la monocouche lipidique inférieure est transférée de l’interface air-eau d’un creux Langmuir sur un substrat propre, puis les liposomes fusionnent vers le haut de la monocouche lipidique soutenue et forment le bilayer final39. La reconstitution des protéines membranaires à l’aide de la méthode LB/VF est plus simple que la LB/LS, car la reconstitution peut être effectuée par la fusion des protéoliposomes. Cependant, la fusion des vésicules nécessite l’ajout de liposomes excédentaires, ce qui peut compliquer l’étude des événements membranaires dépendants des interactions protéine-protéine dépendantes de la concentration.
La reconstitution réussie des protéines transmembrane dans les bicouches lipidiques et les liposomes liés au polymère dans une orientation fonctionnelle préférée est importante, mais difficile à appliquer. Des contrôles expérimentaux sont nécessaires pour en tenir compte. Pour les bicouches lipidiques attachées au polymère, il est également important de maintenir l’intégrité de la bicouche lipidique lors de la reconstitution. Les concentrations de surfactants doivent être maintenues relativement faibles pour empêcher la dissolution de la bicouche lipidique, mais suffisamment élevées pour empêcher la dénaturation de la protéine d’intérêt37,40. La méthode décrite ici est idéale pour reconstituer les protéines membranaires pour les études à molécule unique, mais n’est pas nécessairement évolutive pour des études à plus grande échelle. Le choix de Surfactant est une autre considération importante. Fréquemment, le surfactant utilisé pour la purification et le stockage est un bon point de départ. La concentration maximale de surfactant est généralement ~200 fois moins du CMC36, dans une gamme où le surfactant maintient la stabilité des protéines et empêche l’agrégation des protéines, tout en maintenant l’intégrité de la membrane36. Des cocktails contenant 2 ou 3 agents de surf peuvent être considérés. Pour la reconstitution en liposomes, une faible concentration de surfactant n’est pas nécessaire. Cependant, les concentrations de surfactants en dessous de CMC sont préférables pour maintenir la taille uniforme et la distribution de morphologie pour les liposomes. Pour éviter les fuites de colorant de contenu, il est nécessaire de dialer contre un tampon contenant des colorants.
Contrairement aux tests de fusion à base de liposome, la plate-forme que nous avons établie fournit une approche pour étudier la cinétique de chaque étape de la fusion membranaire. Cette méthode permet d’étudier les protéines de fusion transmembranaires dans des conditions quasi indigènes. Les plates-formes membranaires modèles peuvent être appliquées pour étudier l’assemblage et l’oligomérisation des protéines membranaires, la « sculpture » membranaire et les interactions protéines-lipides des protéines dans les environnements subcellulaires, comme la membrane interne mitochondriale. Cette méthode permet également d’explorer d’importantes conditions physiologiques dans l’interaction membrane-protéine, telles que l’asymétrie de composition bilayer. Le rôle d’un lipide mitochondrial clé, la cardiolipine, dans les propriétés de bilayer des liposomes et des bicouches soutenues par polymère reste à définir. Des propriétés telles que la résistance ionique, l’épaisseur de la membrane, la rigidité de la membrane, la courbure de la membrane et les propriétés de viscosité de l’élasticité de la membrane peuvent toutes influencer la capacité des protéines à se réunir en états fonctionnels spécifiques. Les études futures appliquant de façon créative les systèmes de membrane de modèle ont le potentiel de découvrir de nouveaux aspects de l’organisation et de la fonction de protéine de membrane.
The authors have nothing to disclose.
Les auteurs reconnaissent le soutien du Prix de recherche en santé infantile de la Fondation Charles H. Hood et le généreux soutien du Département de biologie moléculaire du Massachusetts General Hospital.
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(Cyanine 5) | Avanti polar lipid | Cat #: 810335C1mg | membrane fluorescent markers |
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt) | Avanti Polar lipids | Cat #: 880130P | lipid molecules |
1',3'-bis[1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho]-glycerol (sodium salt) | Avanti Polar lipids | Cat #: 710335P | lipid molecules |
18:1 (Δ9-Cis) PC (DOPC) | Avanti Polar lipids | Cat #: 850375P | lipid molecules |
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine | Avanti Polar lipids | Cat #: 850757P | lipid molecules |
Alexa Fluor 488 Antibody Labeling Kit | ThermoFisher Scientific | A20181 | |
Amber vial with PTFE liner | Fisher scientific | 14-955-332 | sample vials to keep lipid solutions |
Calcein | Sigma-Aldrich | Cat #: C0875; PubChem Substance ID: 24892279 | fluorescent dye |
Chloroform | Fisher scientific | 298-500/ C295-4 | Fisher brand Chloroform is usually quite reliable for lipid works. |
Concavity slide (1 well) | Electron Microscopy Science | 71878-05 | applied as Schaefer Slide |
FCS analysis tool | Smith Lab, University of Akron | software tool | |
Fiji /ImageJ | Fiji | SCR_002285 | software tool |
Fisherbrand Cover Glasses: Circles | Fisher scientific | 12-545-102 | Cover glass for solid supported lipid bilayers, the item is now discontinued as authors prepared the manuscript. An alternative is Fisher brand premium cover glass with catalog number: 12-548-5M |
GTP Disodium salt | SIGMA-ALDRICH INC | Cat #: 10106399001 | |
Langmuir & Langmuir-Blodgett Trough | Biolin Scientifc | KN2002 | |
L-α-lysophosphatidylinositol (Liver, Bovine) (sodium salt) | Avanti Polar lipids | Cat #: 850091P | lipid molecules |
Mini Extruder | Avanti Polar lipids | 610020 | |
n-Dodecyl-β-D-Maltopyranoside | Anatrace | Cat #: D310 25 GM | surfactant for reconstitution |
n-Octyl-α-D-Glucopyranoside | Anatrace | Cat #: O311HA 25 GM | surfactant for reconstitution |
PC Membranes 0.2μm | Avanti Polar Lipids | 610006 | |
Rabbit Anti-Opa1 antibody | NOVUS BIOLOGICALS | Cat #: NBP2-59770 | antibody for Opa1 C-terminal detection |
Slidebook | Intelligent imaging | RRID: SCR_014300 | software tool |
Teflon threaded seal tape | Fisher Scientific | NC0636085 | taflon tape for sample storage |
Texas Red 1,2-Dihexadecanoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine, Triethylammonium Salt (Texas Red DHPE) | ThermoFisher Scientific | Cat #: T1395MP | membrane fluorescent markers |