Mitokondriyal füzyon mitokondriyal dinamiğin altında yatan önemli bir homeostatik reaksiyondur. Burada açıklanan bir in vitro reconstitution sistemi membran tethering çözebilir mitokondriyal iç membran füzyon çalışması, yerleştirme, hemifüzyon, ve gözenek açılması. Hücre zarı sistemlerinin araştırılmasında bu yaklaşımın çok yönlülüğü tartışılmıştır.
Mitokondriyal dinamikler organelin çeşitli fonksiyonları ve hücresel tepkiler için gereklidir. Kalabalık, mekansal olarak karmaşık, mitokondriyal membran düzenleyici faktörleri ayırt etmek için zorlu bir ortamdır. Protein ve lipid bileşenlerinin deneysel kontrolü, düzenlemenin belirli sorularının yanıtlatılabilir. Ancak, bu faktörlerin nicel manipülasyon hücresel tahlillerde zordur. Mitokondri iç zar füzyonunun moleküler mekanizmasını araştırmak için mitokondriyal iç zarın lipid ortamını taklit eden bir in vitro reconstitution platformu sunduk. Burada lipid iki katları hazırlamak ve mitokondriyal membran proteinlerini yeniden oluşturmanın ayrıntılı adımlarını açıklıyoruz. Platform, mitokondriyal iç zar füzyonundaki ara girdilerin ve bireysel geçişler için kinetiklerin nicel bir şekilde analizine olanak sağladı. Bu protokol, asimetrik lipid bileşimi ile iki katmanlı imalatı açıklar ve bir yastıklı iki katmanlı içine transmembran proteinleri reconstistied için genel hususlar açıklar. Yöntem diğer membran sistemlerini incelemek için uygulanabilir.
Membran kompartalizasyonu ökaryotik hücrelerin bir özelliğidir1 (Şekil 1A). Biyolojik membranlar giderek iki boyutlu bir çözücü daha fazla olarak kabul edilir, ve protein fonksiyonu ve makromoleküler karmaşık montaj düzenleyen kritik rol oynayan bir ortam olarak kabul edilir2,3. Doğal lipidler membran protein aktivitesini düzenleyen ligandlarvardır 3,4. Membran uzamsal organizasyon ve membranların çeşitli şekiller halinde heykel yeteneği yeni fonksiyonlar seçmek için önemli fiziksel özelliklerivardır 3,5.
Model membran platformları bize hücresel membran yapısı, dinamikleri ve fonksiyonu6,7,,8anlamamıza yardımcı olabilir biyomimetik sistemlerdir. Model membranlar tipik olarak tanımlanmış biyofiziksel özelliklere (sertlik, kalınlık ve elastikiyet) sahip iyi tanımlanmış bileşimin lipid karışımını oluşturur. Floresan görüntüleme ile birleştiğinde, model membran platformları membran yapısı vefonksiyonununkantitatif analizisağlar 9,10,11. Lipid iki katmanlı reconstitution stratejileri SNARE aracılı membran füzyon9,,10, DNA aracılı membran füzyon12ve viral füzyon11,13çalışma için kullanılmıştır. Bu tür yöntemlerin bir avantajı gözlemlenebilir bir reaksiyon olay14öncesinde ara adımlar için kinetik bilgi elde etmek için potansiyeldir.
Plazma membranı model membranlar kullanılarak kapsamlı bir şekilde incelenmiştir. Lipid faz ayrıştırma ile bilayers hücrelisinyalizasyon önemlilipid sal yapıları çalışmak için geliştirilmiştir 11,15,16. Mikro desenli lipid düzlemsel iki katmanlı17,18 hücre reseptörlerinin organizasyonunu araştırmak için kullanılmıştır. Polimer veya jel destekli membranlar membran-sitoiskelet organizasyonu, hücre sinyalizasyonu sırasında membran protein bölünmesi ve hücre-hücre temaslarında göç19incelemek için biyomimetik sistemler olarak kullanılmıştır.
Yapay membran sistemleri de hücre altı organelleri20çalışma için uygulanmaktadır. Organeller farklı alt ortamlar oluşturan karakteristik morfolojilere sahiptir. Endoplazmik retikulum (ER) ağı bunun bir örneğidir. Retikulonların lipozomlara dönüştürülmesi üzerine hücresel ER’ye benzer özelliklere sahip tübüler membran yapıları21’deoluşur. Atlastin eklenmesi, bir ER füzyon proteini, bir ağ oluşturmak için lipozomlardan lipid tübülleri neden olabilir20. Bu, proteolopozomların organel morfolojisi ve dinamiği hakkında fonksiyonel içgörü nasıl sağlayabileceğinin bir örneğidir.
Mitokondriyal membran füzyonu ve fizyonu mitokondriyalpopülasyon22,,23,,24,25sağlığı için gereklidir. Dinamin familyasından gtpaslar mitokondri membran füzyonu katalizler. Mfn 1/2 dış membran füzyonkatalize. Opa1 iç zar füzyon26 (Şekil 1B)aracılık eder. Opa1’in iki şekli vardır: uzun bir form (l-Opa1), mitokondriyal iç zara bağlı transmembran ve intermembran uzayında bulunan ‘çözünür’ kısa form (s-Opa1). İki Opa1 formlarının oranı iki proteaz, Oma1 ve Yme1L27,28,,29,30aktivitesi ile düzenlenir. Opa1 yönetmeliğinde önemli sorular şunlardır: Opa1 iki formları, (kısa ve uzun) membran füzyon ve düzenleyici etkileşim28,29,31,32,33aracılık nasıl .
Burada, l- ve s-Opa1’in iç zar füzyonundaki rollerini açıklığa kavuşturan mitokondriyal iç zar füzyonu araştırmak için başarıyla uygulanan bir yeniden yapılanma stratejisini açıklıyoruz. Polimer-tethered lipid çift katmanlı ve 200 nm unilamellar veziküller kullanarak mitokondriyal iç membranı taklit eden bir platform geliştirdik. Lipid bilayer altında bir polimer tether faydaları şunlardır. İlk olarak, aksi takdirde cam slayt34yakınlığı ile bozulabilir yeniden transmembran protein, korur. İkinci olarak, lipid çift katmanlı ve cam substrat arasında kalın bir su tabakası hizmet vermektedir, hangi gözenek açma çalışmaları kolaylaştırır9, ve üçüncü PEG polimer viskoelastik doğa membran eğrilik değişiklikleri sağlar35. Membran füzyonundaki basamakları karakterize etmek için üç renkli floresan görüntüleme kullandık (Şekil 1C-F).
Şekil 1: Mitokondriyal membran füzyonunun izlenmesi.
(A) Organeller hücre zarı bölmeleridir. (B) Mitokondriyal membran füzyonunun sıralı basamakları. Mitokondrinin dış zarının füzyonu Mfn1 ve/veya Mfn2 ile katalize edilirken, iç zar füzyonu Opa1 ile aracılık edilir. (C-F) Mitokondriyal membran füzyonu incelemek için in vitro reconstitution platformunun şeması. Platform iki bölümden oluşmaktadır: proteolizom ve polimer-tethered lipid çift katmanlı, her ikisi de yeniden l-Opa1 ile. Floresan etiketler, iki farklı floresan membran boyaları ve bir içerik belirteci de dahil olmak üzere, membran füzyon sırasında adımları ayırt yardımcı olur. İki membran belirteçleri (Cy5-PE (kırmızı) ve TexasRed PE (turuncu) yakın membran yerleştirme rapor edebilirsiniz bir FRET çifti yapmak. TexasRed-PE’nin proteolipozom etiketleyen difüzyonu lipid demiksinin (hemifüzyon) bir göstergesidir. İçerik salınımı calcein sinyalinin dequenching yoluyla izlenir (yeşil gösterilir). A ve B panelleri Biorender kullanılarak oluşturuldu. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
In vitro model-membran sistemleri iyi tanımlanmış koşullar altında karmaşık membran süreçlerini tanımlayabilir. Bu sistemler moleküler mekanizmalarıortayaçıkarmak için karmaşık moleküler süreçler için gerekli minimal bileşenleri ayırt edebilirsiniz 6,15,20,38. Membran proteinleri için lipozomlar ve düzlemsel destekli iki tabakalar yaygın yeniden yapılanma sistemleridir. Katı destekli lipid iki katmanlı aksine, polimer-bağlı iki katmanlı substrat ve desteklenen membran arasındaki polimer yastık büyük membran proteinlerinin serbest hareketlilik sağlar, ve transmembran-proteinler diffüz ve serbestçe monte34. Bu özellikler mitokondri iç zar füzyon36kinetik araştırmak yardımcı oldu.
Langmuir-Blodgett/Langmuir-Schaefer (LB/LS) tekniklerini kullanarak polimer-tethered lipid bilayer hazırladık. Bu bize asimetrik lipid bileşenleri ile bir iki katmanlı hazırlamak için izin verir. Hücresel membranlar asimetrik broşür bileşimi var, ve LB / LS yaklaşımı gibi iki katmanlı çalışma sağlar. Schaefer transferi ile, bütün bir cam substrat bir lipid iki katmanlı ile kaplı olabilir. İki katmanlı hazırlık için temiz bir yüzey hazırlamak çok önemlidir. Ayrıca, doğru bir Schaefer transferi gerçekleştirmek için uygulama alır. Başarısız Schaefer transferi bir lipid bilayer istenmeyen kusurları oluşturabilirsiniz. Bu protokolde, film dengesine eklenen basınç %20 kardiyolipin içeren iki katmanlı bir basınç için geçerlidir. Diğer bileşenlere sahip iki katmanlar için, temel bileşenlerin yüzey basınç alanı isotherm bakın. Alternatif bir yöntem Langmuir-Blodgett / vezikül füzyon (LB / VF) yöntemi, alt lipid monolayer temiz bir substrat üzerine bir Langmuir yalak hava-su arabiriminden aktarılır nerede, sonra lipozomlar desteklenen lipid monolayer üstüne sigorta ve son iki katmanlı formu39. LB/VF yöntemini kullanan membran proteinlerinin yeniden yapılandırılması LB/LS’den daha basittir, çünkü proteolipozomların füzyonu ile reconstitution yapılabilir. Ancak, vezikül füzyonu aşırı lipozomların eklenmesini gerektirir, bu da konsantrasyona bağımlı protein-protein etkileşimlerine bağlı membran olaylarının çalışmasını zorlaştırabilir.
Transmembran proteinlerinin hem polimer-tethered lipid iki katmanlı hem de lipozomlar içine başarılı bir şekilde yeniden yapılandırılması, tercih edilen fonksiyonel oryantasyonda önemlidir, ancak uygulanması zordur. Bunu hesaba katmak için deneysel kontrollere ihtiyaç vardır. Polimer-tethered lipid iki katları için, aynı zamanda reconstitution sırasında lipid iki katmanlı bütünlüğünü korumak için önemlidir. Sürfaktan konsantrasyonları lipid iki katmanlı çözülmesini önlemek için nispeten düşük tutulmalıdır, ancak ilgi protein denatürasyon önlemek için yeterince yüksek37,40. Burada açıklanan yöntem, membran proteinlerinin tek moleküllü çalışmalar için yeniden konumlandırması için idealdir, ancak daha büyük ölçekli çalışmalar için ölçeklenebilir olması gerekmez. Sürfaktan seçimi bir diğer önemli husustur. Sık sık, saflaştırma ve depolama için kullanılan yüzey aktif iyi bir başlangıç noktasıdır. Yüzey aktif madde maksimum konsantrasyonu genellikle ~ 200 kez daha az CMC36, yüzey aktif protein kararlılığını korur ve protein toplama önler bir aralıkta, membran bütünlüğünü korurken36. 2 veya 3 yüzey aktif madde içeren kokteyller düşünülebilir. Lipozomlara yeniden yapılabilmesi için düşük konsantrasyonda yüzey aktif madde ye gerek yoktur. Ancak, CMC altında yüzey aktif konsantrasyonları lipozomlar için tek tip boyutu ve morfoloji dağılımı korumak için tercih edilir. İçerik boyasının kaçmasını önlemek için, boya içeren arabelleğe karşı diyaliz edersiniz.
Lipozom bazlı füzyon testlerinin aksine, kurduğumuz platform membran füzyonunun her adımının kinetiklerini araştırmak için bir yaklaşım sağlar. Bu yöntem, transmembran füzyon proteinlerini yakın yerli koşullarda inceleme olanağı sağlar. Model membran platformları membran protein montajı ve oligomerizasyon, membran “heykel” ve mitokondriyal iç membran gibi hücrealtı ortamlarda proteinlerin protein-lipid etkileşimleri çalışma için uygulanabilir. Bu yöntem aynı zamanda membran-protein etkileşiminde iki katmanlı kompozisyon asimetrisi gibi önemli fizyolojik koşulların araştırılmasına da olanak sağlar. Hem lipozomların hem de polimer destekli iki katmanlı özelliklerinde önemli bir mitokondriyal lipid, kardiyolipinin rolü tanımlanmamıştır. Iyonik mukavemet, membran kalınlığı, membran sertliği, membran eğriliği ve membran elastik viskozite özellikleri gibi özellikler proteinlerin belirli fonksiyonel durumlara uyuma yeteneğini etkileyebilir. Model membran sistemlerini yaratıcı bir şekilde uygulayan ileride yapılan çalışmalar, membran protein organizasyonu ve işlevinin yeni yönlerini ortaya çıkarabilecek potansiyele sahiptir.
The authors have nothing to disclose.
Yazarlar Charles H. Hood Vakfı Çocuk Sağlığı Araştırma Ödülü ve Massachusetts Genel Hastanesi Moleküler Biyoloji Bölümü cömert destek destek kabul.
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(Cyanine 5) | Avanti polar lipid | Cat #: 810335C1mg | membrane fluorescent markers |
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt) | Avanti Polar lipids | Cat #: 880130P | lipid molecules |
1',3'-bis[1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho]-glycerol (sodium salt) | Avanti Polar lipids | Cat #: 710335P | lipid molecules |
18:1 (Δ9-Cis) PC (DOPC) | Avanti Polar lipids | Cat #: 850375P | lipid molecules |
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine | Avanti Polar lipids | Cat #: 850757P | lipid molecules |
Alexa Fluor 488 Antibody Labeling Kit | ThermoFisher Scientific | A20181 | |
Amber vial with PTFE liner | Fisher scientific | 14-955-332 | sample vials to keep lipid solutions |
Calcein | Sigma-Aldrich | Cat #: C0875; PubChem Substance ID: 24892279 | fluorescent dye |
Chloroform | Fisher scientific | 298-500/ C295-4 | Fisher brand Chloroform is usually quite reliable for lipid works. |
Concavity slide (1 well) | Electron Microscopy Science | 71878-05 | applied as Schaefer Slide |
FCS analysis tool | Smith Lab, University of Akron | software tool | |
Fiji /ImageJ | Fiji | SCR_002285 | software tool |
Fisherbrand Cover Glasses: Circles | Fisher scientific | 12-545-102 | Cover glass for solid supported lipid bilayers, the item is now discontinued as authors prepared the manuscript. An alternative is Fisher brand premium cover glass with catalog number: 12-548-5M |
GTP Disodium salt | SIGMA-ALDRICH INC | Cat #: 10106399001 | |
Langmuir & Langmuir-Blodgett Trough | Biolin Scientifc | KN2002 | |
L-α-lysophosphatidylinositol (Liver, Bovine) (sodium salt) | Avanti Polar lipids | Cat #: 850091P | lipid molecules |
Mini Extruder | Avanti Polar lipids | 610020 | |
n-Dodecyl-β-D-Maltopyranoside | Anatrace | Cat #: D310 25 GM | surfactant for reconstitution |
n-Octyl-α-D-Glucopyranoside | Anatrace | Cat #: O311HA 25 GM | surfactant for reconstitution |
PC Membranes 0.2μm | Avanti Polar Lipids | 610006 | |
Rabbit Anti-Opa1 antibody | NOVUS BIOLOGICALS | Cat #: NBP2-59770 | antibody for Opa1 C-terminal detection |
Slidebook | Intelligent imaging | RRID: SCR_014300 | software tool |
Teflon threaded seal tape | Fisher Scientific | NC0636085 | taflon tape for sample storage |
Texas Red 1,2-Dihexadecanoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine, Triethylammonium Salt (Texas Red DHPE) | ThermoFisher Scientific | Cat #: T1395MP | membrane fluorescent markers |