La fusione mitocondriale è un’importante reazione omeostatica alla base delle dinamiche mitocondriali. Descritto qui è un sistema di ricostituzione in vitro per studiare la fusione mitocondriale interno-membrana che può risolvere il tethering della membrana, docking, emifusione, e l’apertura pore. Viene discussa la versatilità di questo approccio nell’esplorazione dei sistemi a membrana cellulare.
La dinamica mitocondriale è essenziale per le diverse funzioni e risposte cellulari dell’organello. L’affollata, spazialmente complessa, membrana mitocondriale è un ambiente impegnativo per distinguere i fattori normativi. Il controllo sperimentale dei componenti proteici e lipididi può aiutare a rispondere a domande specifiche di regolazione. Tuttavia, la manipolazione quantitativa di questi fattori è difficile nei saggi cellulari. Per studiare il meccanismo molecolare della fusione mitocondri interno-membrana, abbiamo introdotto una piattaforma di ricostituzione in vitro che imita l’ambiente lipidico della membrana interna mitocondriale. Qui descriviamo passaggi dettagliati per la preparazione di bistrati lipididi e la ricostituzione delle proteine della membrana mitocondriale. La piattaforma ha permesso l’analisi degli intermedi nella fusione mitocondriale interno-membrana, e la cinetica per le singole transizioni, in modo quantitativo. Questo protocollo descrive la fabbricazione di bistrati con composizione lipicida asimmetrica e descrive considerazioni generali per la ricostituzione delle proteine transmembrane in un bistrato ammortizzato. Il metodo può essere applicato per studiare altri sistemi di membrana.
La compartimentazione delle membrane è un segno distintivo delle celluleeucariotiche 1 (Figura 1A). Le membrane biologiche sono sempre più riconosciute come più di un solvente bidimensionale e sono considerate come un ambiente che gioca un ruolo fondamentale nella regolazione della funzione proteica e dell’assemblaggio complesso macromolecolare2,3. I lipidi nativi sono ligand che regolano l’attività proteica dellamembrana 3,4. L’organizzazione spaziale della membrana e la capacità delle membrane di essere scolpite in forme diverse sono importanti proprietà fisiche per la selezione di nuovefunzioni 3,5.
Le piattaforme a membrana modello sono sistemi biomimetici che possono aiutarci a comprendere la struttura della membrana cellulare, la dinamica ela funzione 6,7,8. Le membrane modellotiche comprendono tipicamente una miscela lipidica di composizione ben definita, con proprietà biofisiche definite (rigidità, spessore ed elasticità). Accoppiate all’imaging a fluorescenza, le piattaforme di membrana modello consentono l’analisi quantitativa della struttura dellamembranae della funzione 9,10,11. Le strategie di ricostituzione dei bistrati di lipidi sono state utilizzate per studiare la fusione della membrana mediata da SNARE9,10, la fusione della membrana mediata dal DNA12e la fusione virale11,13. Un vantaggio di tali metodi è la possibilità di ottenere informazioni cinetiche per i passaggi intermedi che precedono un evento di reazione osservabile14.
La membrana plasmatica è stata ampiamente studiata utilizzando membrane modello. I bistrati con separazione di fase lipibile sono stati sviluppati per studiare le strutture di zattera lipidiche importanti nella segnalazionecellulare 11,15,16. Micromodelli lipididi planari17,18 sono stati utilizzati per indagare l’organizzazione dei recettori cellulari. Le membrane polimeriche o supportate da gel sono state utilizzate come sistemi biomimetici per studiare l’organizzazione membrana-citoscheletro, il partizionamento delle proteine della membrana durante la segnalazione cellulare e la migrazione ai contatticellulare 19.
I sistemi di membrana artificiale vengono applicati anche allo studio degli organelli subcellulari20. Gli organelli presentano morfologie caratteristiche che creano sotto-ambienti distinti. La rete endoplasmic reticulum (ER) è un esempio. Dopo la ricostituzione dei reticoloni in liposomi, le strutture a membrana tubolare con proprietà simili al ER cellulare sonoformate 21. L’aggiunta di atlastina, una proteina di fusione ER, può indurre tubù lipidi da liposomi a formare una rete20. Questo è un esempio di come i proteoliposomi possono fornire una visione funzionale della morfologia e della dinamica degli organelli.
La fusione e fissione della membrana mitocondriale sono essenziali per la salute della popolazione mitocondriale22,23,24,25. Un insieme di gtPases della famiglia di dynamina catalizza la fusione della membrana dei mitocondri. Mfn 1/2 catalizza la fusione della membrana esterna. Opa1 media la fusione della membranainterna 26 (Figura 1B). Opa1 ha due forme: una forma lunga (l-Opa1), transmembrana-ancorata alla membrana interna mitocondriale, e una forma breve ‘solubile’ (s-Opa1), presente nello spazio intermembrana. Il rapporto tra le due forme Opa1 è regolato dall’attività di due proteasi, Oma1 e Yme1L27,28,29,30. Importanti questioni nel regolamento Opa1 includono: come le due forme di Opa1, (breve e lungo) mediano la fusione della membrana e la loro interazionenormativa 28,29,31,32,33.
Qui descriviamo una strategia di ricostituzione applicata con successo per studiare la fusione mitocondriale interno-membrana che ha chiarito i ruoli di l- e s-Opa1 nella fusione interna-membrana. Abbiamo sviluppato una piattaforma che imita la membrana interna mitocondriale utilizzando un bistrato lipidico con tediche polimero e vesicles unilamellari da 200 nm. I vantaggi di un tether polimerico sotto il bistrato lipidico includono quanto segue. In primo luogo, conserva la proteina transmembrana ricostituita, che altrimenti potrebbe essere interrotta dalla vicinanza allo scivolo di vetro34. In secondo luogo, serve uno spesso strato d’acqua tra il bistrato lipidico e il substrato di vetro, che facilita gli studi di apertura dei pori9,e in terzo luogo la natura viscoelastica del polimero PEG consente cambiamenti di curvatura della membrana35. Abbiamo usato l’imaging a fluorescenza a tre colori per caratterizzare i passaggi nella fusione della membrana (Figura 1C-F).
Figura 1: Monitoraggio della fusione della membrana mitocondriale.
(A) Gli organelli sono compartimenti cellulari della membrana. (B) Fasi sequenziali della fusione della membrana mitocondriale. La fusione della membrana esterna dei mitocondri è catalizzato da Mfn1 e/o Mfn2, mentre la fusione della membrana interna è mediata da Opa1. (C-F) Schematico della piattaforma di ricostituzione in vitro per studiare la fusione della membrana mitocondriale. La piattaforma comprende due parti: un proteoliposome e un bistratore lipidico polimerico, entrambi con l-Opa1 ricostituito. Le etichette fluorescenti, tra cui due diversi coloranti a membrana fluorescente e un marcatore di contenuto, aiutano a distinguere i passi durante la fusione della membrana. I due marcatori di membrana (Cy5-PE (rosso) e TexasRed PE (arancione) fanno una coppia FRET, che può riferire sull’attracco ravvicinato della membrana. La diffusione di TexasRed-PE che etichetta il proteoliposome è un indicatore di demixing lipidico (emifusione). Il rilascio del contenuto viene monitorato attraverso la dequenching del segnale calcein (mostrato in verde). Pannelli A e B creati utilizzando Biorender. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
I sistemi di membrana modello-membrana in vitro possono descrivere processi di membrana complessi in condizioni ben definite. Questi sistemi sono in grado di distinguere i componenti minimi necessari per processi molecolari complessi per rivelare meccanismimolecolari 6,15,20,38. Per le proteine della membrana, i liposomi e i bistrati supportati da planari sono sistemi di ricostituzione comuni. A differenza dei bistrati lipididi a supporto solido, il cuscino polimerico tra il substrato e la membrana supportata in bistrati polimeri consente la mobilità libera di grandi proteine della membrana e le proteine transmembrane per diffondere e assemblareliberamente 34. Queste caratteristiche ci hanno aiutato a studiare la cinetica della fusione della membrana interna deimitocondri 36.
Abbiamo preparato un bistrato lipidico polimerico utilizzando tecniche Langmuir-Blodgett/Langmuir-Schaefer (LB/LS). Questo ci permette di preparare un bistrato con componenti lipidi asimmetrici. Le membrane cellulari hanno una composizione asimmetrica del volantino e l’approccio LB/LS consente lo studio di tali bistrati. Con il trasferimento di Schaefer, un intero substrato di vetro può essere coperto da un bistrato lipidico. È fondamentale preparare una superficie pulita per la preparazione dei bilayer. Inoltre, ci vuole pratica per eseguire correttamente un trasferimento Schaefer. Il trasferimento infruttuoso di Schaefer può creare difetti indesiderati in un bilayer lipidico. In questo protocollo, la pressione aggiunta al bilanciamento della pellicola è applicabile per un bistrato contenente 20% cardiolipin. Per i bistrati con altri componenti, fare riferimento all’isotherm dell’area di pressione superficiale dei componenti chiave. Un metodo alternativo è il metodo Langmuir-Blodgett/vesicle fusion (LB/VF), in cui il monostrato lipidico inferiore viene trasferito dall’interfaccia aria-acqua di un trota Langmuir su un substrato pulito, quindi i liposomi si fondono alla parte superiore del monostrato lipido supportato e formano il bistratofinale 39. La ricostituzione delle proteine della membrana utilizzando il metodo LB/VF è più semplice di LB/LS, poiché la ricostituzione può essere eseguita attraverso la fusione di proteoliposomi. Tuttavia, la fusione della vescicola richiede l’aggiunta di liposomi in eccesso, che possono complicare lo studio degli eventi della membrana dipendenti dalle interazioni proteina-proteina dipendenti dalla concentrazione.
La ricostituzione efficace delle proteine transmembrane in bistrati lipididi polimeri e liposomi in un orientamento funzionale preferito è importante, ma difficile da applicare. I controlli sperimentali sono necessari per tenere conto di questo. Per i bistrati lipididi polimeri, è anche importante mantenere l’integrità del bistrato lipidico durante la ricostituzione. Le concentrazioni di surfactant devono essere mantenute relativamente basse per evitare lo scioglimento del bistrato lipidico, ma abbastanza elevate da prevenire la denaturazione della proteina di interesse37,40. Il metodo qui descritto è ideale per ricostituire le proteine della membrana per studi su una singola molecola, ma non è necessariamente scalabile per studi su larga scala. La scelta di Surfactant è un’altra considerazione importante. Spesso, il surfactant utilizzato per la purificazione e lo stoccaggio è un buon punto di partenza. La concentrazione massima di surfactant è di solito 200 volte meno del CMC36, in una gamma in cui il surfactant mantiene la stabilità delle proteine e impedisce l’aggregazione proteica, pur mantenendo l’integrità dellamembrana 36. Possono essere considerati cocktail contenenti 2 o 3 surfactant. Per la ricostituzione in liposomi, non è necessaria una bassa concentrazione di surfactant. Tuttavia, le concentrazioni di surfactant al di sotto della CMC sono preferibili per mantenere uniforme la distribuzione delle dimensioni e della morfologia per i liposomi. Per evitare perdite di colorante contenuto, è necessario dialyze contro un buffer contenente coloranti.
A differenza dei saggi di fusione a base di liposomi, la piattaforma che abbiamo stabilito fornisce un approccio per studiare la cinetica di ogni fase della fusione della membrana. Questo metodo fornisce la possibilità di studiare le proteine di fusione transmembrana in condizioni quasi autoctone. Le piattaforme di membrana modello possono essere applicate per studiare l’assemblaggio delle proteine della membrana e l’oligomerizzazione, la “scultura” della membrana e le interazioni proteina-lipidico delle proteine in ambienti subcellulari, come la membrana interna mitocondriale. Questo metodo permette anche l’esplorazione di importanti condizioni fisiologiche nell’interazione membrana-proteina, come l’asimmetria della composizione bistrato. Resta da definire il ruolo di un lipidico mitocondriale chiave, cardiolipin, nelle proprietà bistrati sia dei liposomi che dei bistrati supportati dai polimeri. Proprietà come la forza ionica, lo spessore della membrana, la rigidità della membrana, la curvatura della membrana e le proprietà di viscosità elastica della membrana possono influenzare la capacità delle proteine di assemblaggio in stati funzionali specifici. Studi futuri che applicano creativamente sistemi di membrana modello hanno il potenziale per scoprire nuovi aspetti dell’organizzazione e della funzione delle proteine della membrana.
The authors have nothing to disclose.
Gli autori riconoscono il sostegno del Charles H. Hood Foundation Child Health Research Award e il generoso sostegno del Dipartimento di Biologia Molecolare del Massachusetts General Hospital.
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(Cyanine 5) | Avanti polar lipid | Cat #: 810335C1mg | membrane fluorescent markers |
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt) | Avanti Polar lipids | Cat #: 880130P | lipid molecules |
1',3'-bis[1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho]-glycerol (sodium salt) | Avanti Polar lipids | Cat #: 710335P | lipid molecules |
18:1 (Δ9-Cis) PC (DOPC) | Avanti Polar lipids | Cat #: 850375P | lipid molecules |
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine | Avanti Polar lipids | Cat #: 850757P | lipid molecules |
Alexa Fluor 488 Antibody Labeling Kit | ThermoFisher Scientific | A20181 | |
Amber vial with PTFE liner | Fisher scientific | 14-955-332 | sample vials to keep lipid solutions |
Calcein | Sigma-Aldrich | Cat #: C0875; PubChem Substance ID: 24892279 | fluorescent dye |
Chloroform | Fisher scientific | 298-500/ C295-4 | Fisher brand Chloroform is usually quite reliable for lipid works. |
Concavity slide (1 well) | Electron Microscopy Science | 71878-05 | applied as Schaefer Slide |
FCS analysis tool | Smith Lab, University of Akron | software tool | |
Fiji /ImageJ | Fiji | SCR_002285 | software tool |
Fisherbrand Cover Glasses: Circles | Fisher scientific | 12-545-102 | Cover glass for solid supported lipid bilayers, the item is now discontinued as authors prepared the manuscript. An alternative is Fisher brand premium cover glass with catalog number: 12-548-5M |
GTP Disodium salt | SIGMA-ALDRICH INC | Cat #: 10106399001 | |
Langmuir & Langmuir-Blodgett Trough | Biolin Scientifc | KN2002 | |
L-α-lysophosphatidylinositol (Liver, Bovine) (sodium salt) | Avanti Polar lipids | Cat #: 850091P | lipid molecules |
Mini Extruder | Avanti Polar lipids | 610020 | |
n-Dodecyl-β-D-Maltopyranoside | Anatrace | Cat #: D310 25 GM | surfactant for reconstitution |
n-Octyl-α-D-Glucopyranoside | Anatrace | Cat #: O311HA 25 GM | surfactant for reconstitution |
PC Membranes 0.2μm | Avanti Polar Lipids | 610006 | |
Rabbit Anti-Opa1 antibody | NOVUS BIOLOGICALS | Cat #: NBP2-59770 | antibody for Opa1 C-terminal detection |
Slidebook | Intelligent imaging | RRID: SCR_014300 | software tool |
Teflon threaded seal tape | Fisher Scientific | NC0636085 | taflon tape for sample storage |
Texas Red 1,2-Dihexadecanoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine, Triethylammonium Salt (Texas Red DHPE) | ThermoFisher Scientific | Cat #: T1395MP | membrane fluorescent markers |