Mitochondriale Fusion ist eine wichtige panostatische Reaktion, die der mitochondrialen Dynamik zugrunde liegt. Hier wird ein In-vitro-Rekonstitutionssystem beschrieben, um die mitochondriale Innenmembranfusion zu untersuchen, die Membran-Tethering, Andocken, Hämifusion und Porenöffnung auflösen kann. Die Vielseitigkeit dieses Ansatzes bei der Erforschung von Zellmembransystemen wird diskutiert.
Die mitochondriale Dynamik ist für die vielfältigen Funktionen und zellulären Reaktionen der Organelle von wesentlicher Bedeutung. Die überfüllte, räumlich komplexe, mitochondriale Membran ist ein herausforderndes Umfeld, um regulatorische Faktoren zu unterscheiden. Die experimentelle Kontrolle von Protein- und Lipidkomponenten kann helfen, spezifische Regulierungsfragen zu beantworten. Dennoch ist die quantitative Manipulation dieser Faktoren in zellulären Assays eine Herausforderung. Um den molekularen Mechanismus der Mitochondrien-Innenmembranfusion zu untersuchen, haben wir eine In-vitro-Rekonstitutionsplattform eingeführt, die die Lipidumgebung der mitochondrialen Inneren Membran imitiert. Hier beschreiben wir detaillierte Schritte zur Herstellung von Lipid-Bilayern und zur Rekonstituierung von mitochondrialen Membranproteinen. Die Plattform ermöglichte die Analyse von Zwischenprodukten in der mitochondrialen Inneren-Membran-Fusion und der Kinetik für einzelne Übergänge auf quantitative Weise. Dieses Protokoll beschreibt die Herstellung von Bilayern mit asymmetrischer Lipidzusammensetzung und beschreibt allgemeine Überlegungen zur Rekonstituierung von Transmembranproteinen in eine gepolsterte Bilayer. Die Methode kann angewendet werden, um andere Membransysteme zu untersuchen.
Membrankompartalisation ist ein Markenzeichen der eukaryotischen Zellen1 (Abbildung 1A). Biologische Membranen werden zunehmend als mehr als ein zweidimensionales Lösungsmittel erkannt und gelten als eine Umgebung, die eine entscheidende Rolle bei der Regulierung der Proteinfunktion und der makromolekularen komplexen Baugruppe2,3spielt. Native Lipide sind Liganden, die die Membranproteinaktivität regulieren3,4. Membran räumliche Organisation und die Fähigkeit von Membranen in verschiedenen Formen geformt werden wichtige physikalische Eigenschaften für die Auswahl neuer Funktionen3,5.
Modellmembranplattformen sind biomimetische Systeme, die uns helfen können, Zellmembranstruktur, Dynamik und Funktion6,7,8zu verstehen. Modellmembranen bestehen in der Regel aus einer Lipidmischung aus klar definierter Zusammensetzung mit definierten biophysikalischen Eigenschaften (Steifigkeit, Dicke und Elastizität). Gekoppelt mit Fluoreszenz-Bildgebung ermöglichen Modellmembranplattformen die quantitative Analyse der Membranstruktur und -funktion9,10,11. Lipid-Bilayer-Rekonstitutionsstrategien wurden verwendet, um SNARE-vermittelte Membranfusion9,10, DNA-vermittelte Membranfusion12und virale Fusion11,13zu studieren. Ein Vorteil solcher Methoden ist das Potenzial, kinetische Informationen für Zwischenschritte vor einem beobachtbaren Reaktionsereignis14zu erhalten.
Die Plasmamembran wurde mit Modellmembranen ausgiebig untersucht. Bilayer mit Lipidphasentrennung wurden entwickelt, um Lipid-Floßstrukturen zu untersuchen, die für die zelluläre Signalisierung wichtig sind11,15,16. Mikromusterte lipidplanare Bilayer17,18 wurden verwendet, um die Organisation von Zellrezeptoren zu untersuchen. Polymer- oder Gel-unterstützte Membranen wurden als biomimetische Systeme verwendet, um die Membran-Zytoskelett-Organisation, die Membranprotein-Partitionierung während der Zellsignalisierung und die Migration bei Zell-Zellkontakten zu untersuchen19.
Künstliche Membransysteme werden auch zur Untersuchung subzellulärer Organelleneingesetzt 20. Organellen zeichnen sich durch charakteristische Morphologien aus, die unterschiedliche Subumgebungen erzeugen. Das endoplasmatische Retikulum-Netzwerk (ER) ist ein Beispiel. Bei Rekonstitution von Retikulonen in Liposomen werden röhrenförmige Membranstrukturen mit ähnlichen Eigenschaften wie der zelluläre ER gebildet21. Die Zugabe von Atlastin, einem ER-Fusionsprotein, kann Lipidtubuli aus Liposomen zu einem Netzwerk induzieren20. Dies ist ein Beispiel dafür, wie Proteoliposomen funktionelle Einblicke in organelle Morphologie und Dynamik geben können.
Mitochondriale Membranfusion und Spalt sind für die Gesundheit der mitochondrialen Population22,23,24,25wesentlich. Ein Satz von Dynamin Familie GTPases katalysiert Mitochondrien Membranfusion. Mfn 1/2 katalysiert die Außenmembranfusion. Opa1 vermittelt die Innenmembranfusion26 (Abbildung 1B). Opa1 hat zwei Formen: eine lange Form (l-Opa1), die an der mitochondrialen Innenmembran verankert ist, und eine “lösliche” Kurzform (s-Opa1), die im Intermembranraum vorhanden ist. Das Verhältnis der beiden Opa1-Formen wird durch die Aktivität von zwei Proteasen, Oma1 und Yme1L27,28,29,30reguliert. Wichtige Fragen in Opa1 Regulierung sind: wie die beiden Formen von Opa1, (kurz und lang) vermitteln Membranfusion und ihr regulatorisches Zusammenspiel28,29,31,32,33.
Hier beschreiben wir eine Rekonstitutionsstrategie, die erfolgreich angewendet wurde, um die mitochondriale Innenmembranfusion zu untersuchen, die die Rolle von l- und s-Opa1 in der inneren Membranfusion klarstellte. Wir entwickelten eine Plattform, die die mitochondriale Innenmembran mit einem polymergebundenen Lipid-Bilayer und 200 nm unilamellalaren Vesikeln imitiert. Zu den Vorteilen eines Polymertethers unter der Lipid-Bilayer gehören die folgenden. Zunächst bewahrt es das rekonstituierte Transmembranprotein, das sonst durch die Nähe zum Glasschlitten34gestört werden könnte. Zweitens dient es einer dicken Wasserschicht zwischen Lipid-Bilayer und Glassubstrat, die Studien der Porenöffnung9erleichtert, und drittens ermöglicht die viskoelastische Natur des PEG-Polymers Membrankrümmungsänderungen35. Wir verwendeten dreifarbige Fluoreszenz-Bildgebung, um Schritte in der Membranfusion zu charakterisieren (Abbildung 1C-F).
Abbildung 1: Überwachung der mitochondrialen Membranfusion.
(A) Organellen sind Zellmembrankompartimente. (B) Sequenzielle Schritte der mitochondrialen Membranfusion. Die Verschmelzung der äußeren Membran von Mitochondrien wird durch Mfn1 und/oder Mfn2 katalysiert, während die innere Membranfusion durch Opa1 vermittelt wird. (C-F) Schematisch der In-vitro-Rekonstitutionsplattform zur Untersuchung der mitochondrialen Membranfusion. Die Plattform besteht aus zwei Teilen: einem Proteoliposom und einem polymergebundenen Lipid-Bilayer, beide mit rekonstituiertem l-Opa1. Fluoreszierende Etiketten, darunter zwei verschiedene fluoreszierende Membranfarbstoffe und ein Inhaltsmarker, helfen dabei, Schritte während der Membranfusion zu unterscheiden. Die beiden Membranmarker (Cy5-PE (rot) und TexasRed PE (orange) bilden ein FRET-Paar, das über das enge Andocken der Membran berichten kann. Diffusion von TexasRed-PE, die Proteoliposom etikettet, ist ein Indikator für Lipid-Demix (Hemifusion). Die Inhaltsfreigabe wird durch das Dequenching des Calceinsignals (grün dargestellt) überwacht. Die Panels A und B wurden mit Biorender erstellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
In-vitro-Modellmembransysteme können komplexe Membranprozesse unter genau definierten Bedingungen beschreiben. Diese Systeme können minimale Komponenten unterscheiden, die für komplexe molekulare Prozesse erforderlich sind, um molekulare Mechanismen6,15,20,38zu offenbaren. Für Membranproteine sind Liposomen und planar unterstützte Doppelschichten gängige Rekonstitutionssysteme. Im Gegensatz zu festunterstützten Lipid-Doppelschichten ermöglicht das Polymerkissen zwischen Substrat und unterstützter Membran in polymergebundenen Doppelschichten die freie Mobilität großer Membranproteine und Transmembranproteine, um frei zu diffundieren und zu montieren34. Diese Eigenschaften halfen uns, die Kinetik der Mitochondrien-Innenmembranfusion36zu untersuchen.
Wir haben eine polymertete Lipid-Bilayer mit Langmuir-Blodgett/Langmuir-Schaefer (LB/LS) Verfahren vorbereitet. So können wir eine Doppelschicht mit asymmetrischen Lipidkomponenten zubereiten. Zellmembranen haben eine asymmetrische Packungsbeilage, und der LB/LS-Ansatz ermöglicht die Untersuchung solcher Doppelschichten. Mit Schaefer-Transfer kann ein ganzes Glassubstrat mit einer Lipid-Bilayer abgedeckt werden. Es ist wichtig, eine saubere Oberfläche für die Bilayer-Vorbereitung vorzubereiten. Zusätzlich braucht es Übung, um einen Schaefer-Transfer korrekt durchzuführen. Eine erfolglose Schaefer-Übertragung kann unerwünschte Defekte in einer Lipid-Bilayer verursachen. In diesem Protokoll ist der Druck, der der Filmwaage zugesetzt wird, für eine Bischicht mit 20% Cardiolipin anwendbar. Für Doppelschichten mit anderen Komponenten finden Sie die Oberflächendruckflächenisotherme der Schlüsselkomponenten. Eine alternative Methode ist die Langmuir-Blodgett/Vesicle Fusion (LB/VF) Methode, bei der die untere Lipidmonoschicht von der Luft-Wasser-Schnittstelle eines Langmuir-Trogs auf ein sauberes Substrat übertragen wird, dann Liposomen an die Oberseite der unterstützten Lipidmonoschicht verschmelzen und die endgültige Doppelschicht39bilden. Die Rekonstitution von Membranproteinen mit der LB/VF-Methode ist einfacher als LB/LS, da die Rekonstitution durch die Fusion von Proteoliposomen durchgeführt werden kann. Die Vesikelfusion erfordert jedoch die Zugabe von überschüssigen Liposomen, was die Untersuchung von Membranereignissen erschweren kann, die von konzentrationsabhängigen Protein-Protein-Wechselwirkungen abhängig sind.
Die erfolgreiche Rekonstitution von Transmembranproteinen in polymergebundene Lipid-Doppelschichten und Liposomen in bevorzugter funktioneller Ausrichtung ist wichtig, aber schwer durchsetzbar. Um dies zu berücksichtigen, sind experimentelle Kontrollen erforderlich. Für polymergebundene Lipid-Doppelschichten ist es auch wichtig, die Integrität der Lipid-Doppelschicht während der Rekonstitution zu erhalten. Die Tensidkonzentrationen müssen relativ niedrig gehalten werden, um eine Auflösung der Lipid-Bilayer zu verhindern, aber hoch genug, um eine Denaturierung des in Interesse sindden Proteins zu verhindern37,40. Die hier beschriebene Methode ist ideal für die Rekonstituierung von Membranproteinen für Einzelmolekülstudien, ist aber nicht unbedingt für größere Studien skalierbar. Die Entscheidung für Tensidisten ist eine weitere wichtige Überlegung. Häufig ist das zur Reinigung und Lagerung verwendete Tensid ein guter Ausgangspunkt. Die maximale Konzentration von Tensid ist in der Regel 200 mal weniger von der CMC36, in einem Bereich, in dem das Tensid die Proteinstabilität aufrechterhält und die Proteinaggregation verhindert, während die Integrität der Membran36erhalten bleibt. Cocktails mit 2 oder 3 Tensiden können in Betracht gezogen werden. Zur Rekonstitution zu Liposomen ist eine geringe Konzentration von Tensid nicht erforderlich. Tensidkonzentrationen unterhalb von CMC sind jedoch vorzuziehen, um eine gleichmäßige Größe und Morphologieverteilung für die Liposomen aufrechtzuerhalten. Um das Auslaufen von Inhaltsfarbstoffen zu verhindern, ist es notwendig, gegen einen farbstoffhaltigen Puffer zu dialysieren.
Im Gegensatz zu Liposomen-basierten Fusionstests bietet die von uns etablierte Plattform einen Ansatz, um die Kinetik jedes Schritts der Membranfusion zu untersuchen. Diese Methode bietet die Möglichkeit, Transmembran-Fusionsproteine unter nahezu nativen Bedingungen zu untersuchen. Modellmembranplattformen können zur Untersuchung der Membranprotein-Montage und-Oligomerisierung, der Membran-“Skulptur” und der Protein-Lipid-Wechselwirkungen von Proteinen in subzellulären Umgebungen, wie der mitochondrialen Inneren Membran, eingesetzt werden. Diese Methode ermöglicht auch die Erforschung wichtiger physiologischer Bedingungen im Membran-Protein-Interspiel, wie z. B. Bilayer-Zusammensetzungsasymmetrie. Die Rolle eines wichtigen mitochondrialen Lipids, Cardiolipin, in den bilayern Eigenschaften sowohl von Liposomen als auch von polymerunterstützten Doppelschichten muss noch definiert werden. Eigenschaften wie Ionenstärke, Membrandicke, Membransteifigkeit, Membrankrümmung und Membran-Elastizitätsviskositätseigenschaften können die Fähigkeit von Proteinen beeinflussen, sich in bestimmte Funktionszustände zu montieren. Zukünftige Studien, die Modellmembransysteme kreativ anwenden, haben das Potenzial, neue Aspekte der Membranproteinorganisation und -funktion aufzudecken.
The authors have nothing to disclose.
Die Autoren würdigen die Unterstützung des Charles H. Hood Foundation Child Health Research Award und die großzügige Unterstützung durch das Department of Molecular Biology am Massachusetts General Hospital.
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(Cyanine 5) | Avanti polar lipid | Cat #: 810335C1mg | membrane fluorescent markers |
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt) | Avanti Polar lipids | Cat #: 880130P | lipid molecules |
1',3'-bis[1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho]-glycerol (sodium salt) | Avanti Polar lipids | Cat #: 710335P | lipid molecules |
18:1 (Δ9-Cis) PC (DOPC) | Avanti Polar lipids | Cat #: 850375P | lipid molecules |
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine | Avanti Polar lipids | Cat #: 850757P | lipid molecules |
Alexa Fluor 488 Antibody Labeling Kit | ThermoFisher Scientific | A20181 | |
Amber vial with PTFE liner | Fisher scientific | 14-955-332 | sample vials to keep lipid solutions |
Calcein | Sigma-Aldrich | Cat #: C0875; PubChem Substance ID: 24892279 | fluorescent dye |
Chloroform | Fisher scientific | 298-500/ C295-4 | Fisher brand Chloroform is usually quite reliable for lipid works. |
Concavity slide (1 well) | Electron Microscopy Science | 71878-05 | applied as Schaefer Slide |
FCS analysis tool | Smith Lab, University of Akron | software tool | |
Fiji /ImageJ | Fiji | SCR_002285 | software tool |
Fisherbrand Cover Glasses: Circles | Fisher scientific | 12-545-102 | Cover glass for solid supported lipid bilayers, the item is now discontinued as authors prepared the manuscript. An alternative is Fisher brand premium cover glass with catalog number: 12-548-5M |
GTP Disodium salt | SIGMA-ALDRICH INC | Cat #: 10106399001 | |
Langmuir & Langmuir-Blodgett Trough | Biolin Scientifc | KN2002 | |
L-α-lysophosphatidylinositol (Liver, Bovine) (sodium salt) | Avanti Polar lipids | Cat #: 850091P | lipid molecules |
Mini Extruder | Avanti Polar lipids | 610020 | |
n-Dodecyl-β-D-Maltopyranoside | Anatrace | Cat #: D310 25 GM | surfactant for reconstitution |
n-Octyl-α-D-Glucopyranoside | Anatrace | Cat #: O311HA 25 GM | surfactant for reconstitution |
PC Membranes 0.2μm | Avanti Polar Lipids | 610006 | |
Rabbit Anti-Opa1 antibody | NOVUS BIOLOGICALS | Cat #: NBP2-59770 | antibody for Opa1 C-terminal detection |
Slidebook | Intelligent imaging | RRID: SCR_014300 | software tool |
Teflon threaded seal tape | Fisher Scientific | NC0636085 | taflon tape for sample storage |
Texas Red 1,2-Dihexadecanoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine, Triethylammonium Salt (Texas Red DHPE) | ThermoFisher Scientific | Cat #: T1395MP | membrane fluorescent markers |