Митохондриальный синтез является важной гомеостатической реакцией, лежащей в основе митохондриальной динамики. Описана здесь система восстановления in vitro для изучения митохондриального синтеза внутренней мембраны, которая может решить мембранные привязывания, стыковки, гемифузии и открытия пор. Обсуждается универсальность этого подхода при изучении клеточных мембранных систем.
Митохондриальная динамика имеет важное значение для различных функций органеллы и клеточных реакций. Переполненная, пространственно сложная митохондриальная мембрана является сложной средой для различения регуляторных факторов. Экспериментальный контроль белковых и липидных компонентов может помочь ответить на конкретные вопросы регулирования. Тем не менее, количественное манипулирование этими факторами является сложной задачей в клеточном анализе. Для исследования молекулярного механизма синтеза внутренней мембраны митохондрий мы внедрили платформу экстракорпорального восстановления, которая имитирует липидную среду митохондриальной внутренней мембраны. Здесь мы описываем подробные шаги по подготовке липидных билейеров и восстановлению митохондриальных мембранных белков. Платформа позволила количественно провести анализ промежуточных элементов в митохондриальном синтезе внутренней мембраны и кинетики для отдельных переходов. Этот протокол описывает изготовление билейеров с асимметричным липидным составом и описывает общие соображения для восстановления трансмембранных белков в мягкий билейер. Метод может быть применен для изучения других мембранных систем.
Мембранная разобщенизация является отличительной чертой эукариотическихклеток 1 (рисунок 1A). Биологические мембраны все чаще признаются как более чем двумерный растворитель, и рассматриваются как окружающая среда, играющая важную роль в регулировании функции белка и макромолекулярногокомплекса сборки 2,,3. Родные липиды лиганды, которые регулируют активность мембранногобелка 3,4. Мембранная пространственная организация и способность мембран быть скульптурные в различные формы являются важными физическими свойствами для выбора новыхфункций 3,,5.
Модель мембранных платформ – это биомиметические системы, которые могут помочь нам понять структуру клеточных мембран, динамикуи функцию6,7,,8. Модельные мембраны обычно состоят из липидной смеси четко определенного состава, с определенными биофизическими свойствами (жесткость, толщина и эластичность). В сочетании с флуоресценцией изображения, модели мембранных платформ позволяют количественныйанализ структуры мембраны ифункции9 ,10,11. Липидный bilayer стратегии восстановления были использованы для изучения SNARE-опосредованноеслияние мембраны 9,10, ДНК-опосредованное слияниемембраны 12, ивирусный синтез 11,13. Преимуществом таких методов является возможность получения кинетической информации для промежуточных шагов, предшествующих наблюдаемому событиюреакции 14.
Плазменная мембрана была тщательно изучена с использованием модельных мембран. Билайеры с разделением липидной фазы были разработаны для изучения структур липидного плота, важных в клеточнойсигнализации11,15,,16. Микропаттернные липидные планарныебилейеры 17,18 были использованы для исследования организации клеточных рецепторов. Полимерные или гелеобразующие мембраны используются в качестве биомиметических систем для изучения мембранно-цитоскелетной организации, секционирования мембранного белка во время сигнализации клеток и миграции в контактыклеток-клеток 19.
Искусственные мембранные системы также применяются для изучения подклеточных органелл20. Органеллы имеют характерные морфологии, которые создают различные подсреду. Одним из примеров является эндоплазмическая сеть reticulum (ER). При восстановлении стикулонов в липосомы образуются трубчатые мембранные структуры со свойствами, похожими на клеточныйER. Добавление атластина, белка синтеза ER, может вызвать липидные трубоубийки из липосом, чтобы сформировать сеть20. Это один из примеров того, как протеолипосомы могут обеспечить функциональное понимание органеллы морфологии и динамики.
Митохондриальный синтез мембран и деление имеют важное значение для здоровьямитохондриальной популяции 22,,23,,24,,25. Набор динамин семьи GTPases катализирует митохондрии мембраны слияния. Mfn 1/2 катализает слияние внешней мембраны. Opa1 опосредует синтез внутреннеймембраны 26 (рисунок 1B). Opa1 имеет две формы: длинная форма (l-Opa1), трансмембранная, закрепленная на митохондриальной внутренней мембране, и «растворимая» короткая форма (s-Opa1), присутствуют в интермембранном пространстве. Соотношение двух форм Opa1 регулируется активностью двух протеаз, Oma1 и Yme1L27,,28,,29,,30. Важные вопросы в регулировании Opa1 включают в себя: как две формы Opa1, (короткий и длинный) посредником мембраны слиянияи их нормативного взаимодействия 28,29,31,32,33.
Здесь мы описываем стратегию восстановления, успешно применяемую для исследования митохондриального синтеза внутренней мембраны, которая прояснил роль l- и s-Opa1 во внутреннем мембранном синтезе. Мы разработали платформу, имитирующую митохондриальную внутреннюю мембрану с использованием полимерно-привязанного липидного билейера и 200 нм униламелларов. Преимущества полимерного троса под липидным билейером включают в себя следующее. Во-первых, он сохраняет восстановленный трансмембрановый белок, который в противном случае может быть нарушен близостью к стеклянной горке34. Во-вторых, он служит толстым слоем воды между липидным билейером и стеклянным субстратом, что облегчает изучениепор открытия 9,и в-третьих, вязко-вязкостатический характер полимера PEG позволяет мембранной кривизныизменения 35. Мы использовали трехцветную флуоресценцию для характеристики шагов в мембранном синтезе(рисунок 1C-F).
Рисунок 1: Мониторинг синтеза митохондриальных мембран.
(A)Органеллы являются клеточными мембранами отсеков. (B)Последовательные шаги митохондриального синтеза мембран. Слияние внешней мембраны митохондрий катализуется Mfn1 и/или Mfn2, в то время как синтез внутренней мембраны опосредован Opa1. (C-F) Схема платформы восстановления in vitro для изучения митохондриального синтеза мембран. Платформа включает в себя две части: протеолипосому и полимерно-привязанный липидный бислой, оба с восстановленным l-Opa1. Флуоресцентные этикетки, в том числе два различных флуоресцентных мембранных красителя и маркер содержимого, помогают различать шаги во время мембранного синтеза. Два мембранных маркера (Cy5-PE (красный) и TexasRed PE (оранжевый) делают пару FRET, которая может сообщать о близкой мембранной стыковке. Диффузия TexasRed-PE, которая маркирует протеолипосому, является показателем демиксирования липидов (гемифузии). Выпуск содержимого контролируется путем dequenching кальцина сигнала (показано зеленым цветом). Панели A и B созданы с использованием Biorender. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Модель-мембранные системы In vitro могут описывать сложные мембранные процессы в четко определенных условиях. Эти системы могут различать минимальные компоненты, необходимые для сложных молекулярныхпроцессов, чтобы выявитьмолекулярные механизмы 6, 15,,20,,,38. Для мембранных белков липосомы и планарные двуслойные являются распространенными системами восстановления. В отличие от твердо поддерживаемых липидных билейеров, полимерная подушка между субстратом и поддерживаемой мембраной в полимерно-привязанных билейерах позволяет свободно подвижность больших мембранных белков, а трансмембранные белки свободно рассеиватьсяи собирать 34. Эти особенности помогли нам исследовать кинетику митохондрий внутренне-мембранногосинтеза 36.
Мы подготовили полимерно-привязанный липидный билейлер с использованием методов Langmuir-Blodgett/Langmuir-Schaefer (LB/LS). Это позволяет нам подготовить билейер с асимметричными липидными компонентами. Клеточные мембраны имеют асимметричный состав листовок, а подход LB/LS позволяет изучать такие билейеры. При передаче Шефера весь стеклянный субстрат может быть покрыт липидным билейером. Очень важно подготовить чистую поверхность для подготовки билейера. Кроме того, требуется практика для правильного выполнения передачи Шефера. Неудачная передача Шефера может создать нежелательные дефекты в липидном билейзере. В этом протоколе, давление, добавленное к балансу пленки применимо для билейера, содержащего 20% кардиолипин. Для двухслойных с другими компонентами обратитесь к изотерму области поверхностного давления ключевых компонентов. Альтернативным методом является метод лангмуир-Блоджетт/Везикл (LB/VF), при котором нижний липидный монослой переносится из воздушно-водяного интерфейса корыта Лангмуира на чистый субстрат, затем липосомы сливаются с верхней частью поддерживаемого липидного монослой и образуют окончательныйбилейтер 39. Восстановление мембранных белков с использованием метода LB/VF более просто, чем LB/LS, так как восстановление может быть выполнено путем слияния протеолипосом. Однако слияние пузырьков требует добавления избыточных липосом, что может осложнить изучение мембранных явлений, зависящих от концентрациозависимых белково-белковых взаимодействий.
Успешное восстановление трансмембранных белков в полимерно-привязанные липидные билейеры и липосомы в предпочтительной функциональной ориентации имеет важное значение, но трудно обеспечить. Для этого необходимы экспериментальные элементы управления. Для полимерно-привязанных липидных двуслойных, важно также поддерживать целостность липидного билейера во время восстановления. Концентрации сурфактанта должны быть относительно низкими, чтобы предотвратить растворение липидного билейера, но достаточно высоко, чтобы предотвратить денатурациюбелка интереса 37,40. Описанный здесь метод идеально подходит для восстановления мембранных белков для одномекулярных исследований, но не обязательно масштабируем для крупномасштабных исследований. Surfactant выбор является еще одним важным соображением. Часто сурфактант, используемый для очистки и хранения, является хорошей отправной точкой. Максимальная концентрация сурфактанта, как правило, в 200 раз меньше CMC36, в диапазоне, где сурфактант поддерживает стабильность белка и предотвращает агрегацию белка, сохраняя при этом целостностьмембраны 36. Коктейли, содержащие 2 или 3 сурфактантов могут быть рассмотрены. Для восстановления липосомы, низкая концентрация сурфактанта не является необходимым. Тем не менее, концентрации сурфактантов ниже CMC предпочтительнее для поддержания равномерного размера и распределения морфологии для липосом. Чтобы предотвратить утечку содержания красителя, необходимо диализуть против красителя, содержащего буфер.
В отличие от анализа синтеза на основе липосомы, созданная платформой обеспечивает подход к исследованиям кинетики каждого шага мембранного синтеза. Этот метод обеспечивает возможность изучения трансмембранных белков синтеза в почти родных условиях. Модель мембранных платформ может быть применена для изучения сборки мембранного белка и олигомеризации, мембранной «скульптуры» и белково-липидного взаимодействия белков в субклеточных средах, таких как митохондриальная внутренняя мембрана. Этот метод также позволяет изумить важные физиологические условия в мембранно-белковом взаимодействии, такие как асимметрия состава билейера. Роль ключевого митохондриального липида, кардиолипина, в свойствах билейера как липосом, так и полимерных билейеров еще предстоит определить. Такие свойства, как ионная прочность, толщина мембраны, мембранная жесткость, мембранная кривизна и мембранные эластичные свойства, могут влиять на способность белков к сборке в специфические функциональные состояния. Будущие исследования, творчески применяя модель мембранных систем, имеют потенциал, чтобы раскрыть новые аспекты организации и функции мембранного белка.
The authors have nothing to disclose.
Авторы признают поддержку фонда Чарльза Х. Худа Child Health Research Award и щедрую поддержку со стороны Департамента молекулярной биологии в Массачусетской больнице общего профиля.
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(Cyanine 5) | Avanti polar lipid | Cat #: 810335C1mg | membrane fluorescent markers |
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt) | Avanti Polar lipids | Cat #: 880130P | lipid molecules |
1',3'-bis[1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho]-glycerol (sodium salt) | Avanti Polar lipids | Cat #: 710335P | lipid molecules |
18:1 (Δ9-Cis) PC (DOPC) | Avanti Polar lipids | Cat #: 850375P | lipid molecules |
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine | Avanti Polar lipids | Cat #: 850757P | lipid molecules |
Alexa Fluor 488 Antibody Labeling Kit | ThermoFisher Scientific | A20181 | |
Amber vial with PTFE liner | Fisher scientific | 14-955-332 | sample vials to keep lipid solutions |
Calcein | Sigma-Aldrich | Cat #: C0875; PubChem Substance ID: 24892279 | fluorescent dye |
Chloroform | Fisher scientific | 298-500/ C295-4 | Fisher brand Chloroform is usually quite reliable for lipid works. |
Concavity slide (1 well) | Electron Microscopy Science | 71878-05 | applied as Schaefer Slide |
FCS analysis tool | Smith Lab, University of Akron | software tool | |
Fiji /ImageJ | Fiji | SCR_002285 | software tool |
Fisherbrand Cover Glasses: Circles | Fisher scientific | 12-545-102 | Cover glass for solid supported lipid bilayers, the item is now discontinued as authors prepared the manuscript. An alternative is Fisher brand premium cover glass with catalog number: 12-548-5M |
GTP Disodium salt | SIGMA-ALDRICH INC | Cat #: 10106399001 | |
Langmuir & Langmuir-Blodgett Trough | Biolin Scientifc | KN2002 | |
L-α-lysophosphatidylinositol (Liver, Bovine) (sodium salt) | Avanti Polar lipids | Cat #: 850091P | lipid molecules |
Mini Extruder | Avanti Polar lipids | 610020 | |
n-Dodecyl-β-D-Maltopyranoside | Anatrace | Cat #: D310 25 GM | surfactant for reconstitution |
n-Octyl-α-D-Glucopyranoside | Anatrace | Cat #: O311HA 25 GM | surfactant for reconstitution |
PC Membranes 0.2μm | Avanti Polar Lipids | 610006 | |
Rabbit Anti-Opa1 antibody | NOVUS BIOLOGICALS | Cat #: NBP2-59770 | antibody for Opa1 C-terminal detection |
Slidebook | Intelligent imaging | RRID: SCR_014300 | software tool |
Teflon threaded seal tape | Fisher Scientific | NC0636085 | taflon tape for sample storage |
Texas Red 1,2-Dihexadecanoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine, Triethylammonium Salt (Texas Red DHPE) | ThermoFisher Scientific | Cat #: T1395MP | membrane fluorescent markers |