A fusão mitocondrial é uma importante reação homeostática subjacente à dinâmica mitocondrial. Descrito aqui é um sistema de reconstituição in vitro para estudar a fusão mitocondrial de membrana interna que pode resolver amarração de membrana, acoplamento, hemifusão e abertura de poros. Discute-se a versatilidade dessa abordagem na exploração de sistemas de membrana celular.
A dinâmica mitocondrial é essencial para as diversas funções e respostas celulares da organela. A membrana mitocondrial lotada, espacialmente complexa, é um ambiente desafiador para distinguir fatores regulatórios. O controle experimental de componentes proteicos e lipídicos pode ajudar a responder a questões específicas de regulação. No entanto, a manipulação quantitativa desses fatores é desafiadora nos ensaios celulares. Para investigar o mecanismo molecular da fusão da membrana interna mitocôndria, introduzimos uma plataforma de reconstituição in vitro que imita o ambiente lipídudo da membrana interior mitocondrial. Aqui descrevemos passos detalhados para preparar bicamadas lipídicas e reconstituir proteínas de membrana mitocondrial. A plataforma permitiu a análise de intermediários na fusão mitocondrial da membrana interna, e a cinética para transições individuais, de forma quantitativa. Este protocolo descreve a fabricação de bicamadas com composição lipídica assimétrica e descreve considerações gerais para a reconstitução de proteínas transmembranas em uma bicamada amortecida. O método pode ser aplicado para estudar outros sistemas de membrana.
A compartimentação da membrana é uma marca registrada das células eucarióticas1 (Figura 1A). As membranas biológicas são cada vez mais reconhecidas como solventes bidimensionais, e são consideradas como um ambiente que desempenha papéis críticos na regulação da função proteica e no conjunto complexo macromolecular2,3. Lipídios nativos são ligantes que regulam a atividade proteica da membrana3,4. A organização espacial da membrana e a capacidade das membranas de serem esculpidas em diversas formas são propriedades físicas importantes para a seleção de novas funções3,,5.
As plataformas de membrana modelo são sistemas biomiméticos que podem nos ajudar a entender a estrutura da membrana celular, a dinâmica e a função6,,7,,8. As membranas modelo tipicamente compreendem uma mistura lipídica de composição bem definida, com propriedades biofísicas definidas (rigidez, espessura e elasticidade). Acopladas à imagem de fluorescência, as plataformas de membrana modelo permitem a análise quantitativa da estrutura e função da membrana9,,10,,11. Estratégias de reconstituição de bicamadas lipídicas têm sido usadas para estudar a fusão de membrana mediada por SNARE9,,10, fusão de membrana mediada pelo DNA12e fusão viral11,13. Uma vantagem desses métodos é o potencial de obter informações cinéticas para etapas intermediárias que precedem um evento de reação observável14.
A membrana plasmática tem sido extensivamente estudada usando membranas modelo. Bicamadas com separação de fase lipídica foram desenvolvidas para estudar estruturas de jangadas lipídicas importantes na sinalização celular11,,15,16. Bicamadas planar lipídicas micropatteradas17,18 foram usadas para investigar a organização de receptores celulares. As membranas polimeras ou gel têm sido usadas como sistemas biomiméticos para estudar a organização membrana-citoesqueleto, particionamento de proteína de membrana durante a sinalização celular e migração em contatos célula-células19.
Sistemas de membrana artificial também estão sendo aplicados para estudar organelas subcelulares20. Organelas apresentam morfologias características que criam subsemo ambientes distintos. A rede de ânticulo endoplasmático (ER) é um exemplo. Após a reconstituição de reticulantes em lipossomos, estruturas de membrana tubular com propriedades semelhantes ao ER celular são formadas21. A adição de atlastina, uma proteína de fusão ER, pode induzir túbulos lipídicos de lipossomos para formar uma rede20. Este é um exemplo de como os proteoliposomes podem fornecer uma visão funcional sobre morfologia e dinâmica organela.
A fusão e a fissão da membrana mitocondrial são essenciais para a saúde da população mitocondrial22,23,24,,25. Um conjunto de gtpases da família dinamite catalisa fusão de membrana mitocôndrias. Mfn 1/2 catalisa fusão de membrana externa. Opa1 media a fusão da membrana interna26 (Figura 1B). Opa1 tem duas formas: uma forma longa (l-Opa1), transmembrana ancorada na membrana interior mitocondrial, e uma forma curta ‘solúvel’ (s-Opa1), presente no espaço intermembrano. A razão das duas formas Opa1 é regulada pela atividade de dois proteases, Oma1 e Yme1L27,28,29,30. Questões importantes na regulamentação Opa1 incluem: como as duas formas de Opa1, (curta e longa) mediam a fusão da membrana e sua interplay regulatória28,,29,,31,,32,,33.
Aqui descrevemos uma estratégia de reconstituição aplicada com sucesso para investigar a fusão mitocondrial de membrana interna que esclareceu os papéis de l- e s-Opa1 na fusão de membrana interna. Desenvolvemos uma plataforma imitando a membrana interior mitocondrial usando uma bicamada lipídica de polímero e vesículas unilamellar de 200 nm. Os benefícios de uma corda de polímero sob a bicamadas lipídica incluem o seguinte. Primeiro, preserva a proteína transmembrana reconstituída, que de outra forma poderia ser interrompida pela proximidade do deslizamento de vidro34. Em segundo lugar, serve uma espessa camada de água entre a bicamada lipídica e o substrato de vidro, o que facilita estudos de abertura de poros9, e em terceiro lugar a natureza viscoelástica do polímero PEG permite alterações de curvatura de membrana35. Utilizamos imagens de fluorescência tricolor para caracterizar etapas na fusão de membrana(Figura 1C-F).
Figura 1: Monitorando a fusão da membrana mitocondrial.
(A)Organelas são compartimentos de membrana celular. (B) Etapas sequenciais da fusão da membrana mitocondrial. A fusão da membrana externa das mitocôndrias é catalisada por Mfn1 e/ou Mfn2, enquanto a fusão da membrana interna é mediada por Opa1. (C-F) Esquema da plataforma de reconstituição in vitro para estudar a fusão da membrana mitocondrial. A plataforma inclui duas partes: um proteoliposome e um polimer-tethered lipid bilayer, ambos com l-Opa1 reconstituído. Rótulos fluorescentes, incluindo dois diferentes corantes de membrana fluorescente e um marcador de conteúdo, ajudam a distinguir passos durante a fusão da membrana. Os dois marcadores de membrana (Cy5-PE (vermelho) e TexasRed PE (laranja) fazem um par DE FRET, que pode relatar o acoplamento de membrana próxima. A difusão do TexasRed-PE que rotula proteoliposome é um indicador de desmixagem lipídica (hemifusão). A liberação de conteúdo é monitorada através da desmesturação do sinal de calcein (mostrado em verde). Painéis A e B criados usando Biorender. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Sistemas de membrana de modelo in vitro podem descrever processos complexos de membrana em condições bem definidas. Esses sistemas podem distinguir componentes mínimos necessários para processos moleculares complexos revelarem mecanismos moleculares6,,15,,20,38. Para proteínas de membrana, lipossomos e bicamadas apoiadas por planar são sistemas comuns de reconstituição. Em contraste com bicamadas lipídicas de suporte sólido, a almofada de polímero entre o substrato e a membrana suportada em bicamadas de polímero permite a mobilidade livre de grandes proteínas de membrana, e proteínas transmembranas para difundir e montar livremente34. Essas características nos ajudaram a investigar a cinética da fusão de membrana interna mitocôndria36.
Preparamos uma bicamada lipídica de polímero usando técnicas de Langmuir-Blodgett/Langmuir-Schaefer (LB/LS). Isso nos permite preparar uma bicamadas com componentes lipíduos assimétricos. As membranas celulares têm composição de folhetos assimétricos, e a abordagem LB/LS permite o estudo dessas bicamadas. Com a transferência de Schaefer, um substrato de vidro inteiro pode ser coberto por um bicamadorão lipídedo. É fundamental preparar uma superfície limpa para a preparação de bicamadas. Além disso, é preciso prática para realizar uma transferência schaefer corretamente. Transferência schaefer mal sucedida pode criar defeitos indesejados em um bicamado lipídeto. Neste protocolo, a pressão adicionada ao equilíbrio do filme é aplicável para uma bicamada contendo 20% de cardiolipina. Para bicamadas com outros componentes, consulte o isotherm da área de pressão superficial dos componentes-chave. Um método alternativo é o método Langmuir-Blodgett/vesicle fusion (LB/VF), onde a monocamada lipídica inferior é transferida da interface ar-água de um cocho Langmuir em um substrato limpo, em seguida, lipossomos fundem-se ao topo da monocamada lipídica suportada e formam o bicamado final39. A reconstituição de proteínas de membrana usando o método LB/VF é mais simples do que a LB/LS, pois a reconstituição pode ser realizada através da fusão de proteolipóss. No entanto, a fusão vesícula requer a adição de lipossomos em excesso, o que pode complicar o estudo de eventos de membrana dependentes de interações proteicas dependentes de concentração.
A reconstituição bem sucedida de proteínas transmembranas em bicamadas lipídicas e lipossas em uma orientação funcional preferida é importante, mas difícil de aplicar. Controles experimentais são necessários para explicar isso. Para bicamadas lipídicas de polímero, também é importante manter a integridade da bicamada lipídica durante a reconstituição. As concentrações surfactantes devem ser mantidas relativamente baixas para evitar a dissolução da bicamadas lipídicas, mas altas o suficiente para evitar a desnaturação da proteína de interesse37,40. O método descrito aqui é ideal para a reconstitução de proteínas de membrana para estudos de molécula única, mas não é necessariamente escalável para estudos de maior escala. A escolha do surfactante é outra consideração importante. Frequentemente, o surfactante usado para purificação e armazenamento é um bom ponto de partida. A concentração máxima de surfactante é geralmente ~200 vezes menor do CMC36, em uma faixa onde o surfactante mantém a estabilidade da proteína e previne a agregação de proteínas, mantendo a integridade da membrana36. Podem ser considerados coquetéis contendo 2 ou 3 surfactantes. Para a reconstituição em lipossomos, não é necessária uma baixa concentração de surfactante. No entanto, as concentrações surfactantes abaixo da CMC são preferíveis para manter o tamanho uniforme e a distribuição de morfologia para os lipossomos. Para evitar vazamento de corante de conteúdo, é necessário dilícito contra um tampão contendo corante.
Em contraste com os ensaios de fusão baseados em liposome, a plataforma que estabelecemos fornece uma abordagem para investigar a cinética de cada passo da fusão de membrana. Este método fornece a capacidade de estudar proteínas de fusão transmembrana em condições quase nativas. Plataformas de membrana modelo podem ser aplicadas para estudar montagem e oligomerização de proteínas de membrana, “escultura” da membrana e interações proteína-lipídicas de proteínas em ambientes subcelulares, como a membrana interior mitocondrial. Este método também permite a exploração de condições fisiológicas importantes na interação membrana-proteína, como a assimetria de composição bicamadas. O papel de um lipídio mitocondrial chave, cardiolipina, nas propriedades bicamadas de lipossomos e bicamadas apoiadas por polímero permanece a ser definido. Propriedades como a resistência iônica, a espessura da membrana, a rigidez da membrana, a curvatura da membrana e as propriedades de viscosidade elástica da membrana podem influenciar a capacidade das proteínas de serem colocadas em estados funcionais específicos. Estudos futuros que aplicam criativamente sistemas de membrana modelo têm potencial para descobrir novos aspectos da organização e função da proteína da membrana.
The authors have nothing to disclose.
Os autores reconhecem o apoio do Charles H. Hood Foundation Child Health Research Award e o generoso apoio do Departamento de Biologia Molecular do Hospital Geral de Massachusetts.
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(Cyanine 5) | Avanti polar lipid | Cat #: 810335C1mg | membrane fluorescent markers |
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt) | Avanti Polar lipids | Cat #: 880130P | lipid molecules |
1',3'-bis[1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho]-glycerol (sodium salt) | Avanti Polar lipids | Cat #: 710335P | lipid molecules |
18:1 (Δ9-Cis) PC (DOPC) | Avanti Polar lipids | Cat #: 850375P | lipid molecules |
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine | Avanti Polar lipids | Cat #: 850757P | lipid molecules |
Alexa Fluor 488 Antibody Labeling Kit | ThermoFisher Scientific | A20181 | |
Amber vial with PTFE liner | Fisher scientific | 14-955-332 | sample vials to keep lipid solutions |
Calcein | Sigma-Aldrich | Cat #: C0875; PubChem Substance ID: 24892279 | fluorescent dye |
Chloroform | Fisher scientific | 298-500/ C295-4 | Fisher brand Chloroform is usually quite reliable for lipid works. |
Concavity slide (1 well) | Electron Microscopy Science | 71878-05 | applied as Schaefer Slide |
FCS analysis tool | Smith Lab, University of Akron | software tool | |
Fiji /ImageJ | Fiji | SCR_002285 | software tool |
Fisherbrand Cover Glasses: Circles | Fisher scientific | 12-545-102 | Cover glass for solid supported lipid bilayers, the item is now discontinued as authors prepared the manuscript. An alternative is Fisher brand premium cover glass with catalog number: 12-548-5M |
GTP Disodium salt | SIGMA-ALDRICH INC | Cat #: 10106399001 | |
Langmuir & Langmuir-Blodgett Trough | Biolin Scientifc | KN2002 | |
L-α-lysophosphatidylinositol (Liver, Bovine) (sodium salt) | Avanti Polar lipids | Cat #: 850091P | lipid molecules |
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n-Octyl-α-D-Glucopyranoside | Anatrace | Cat #: O311HA 25 GM | surfactant for reconstitution |
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Rabbit Anti-Opa1 antibody | NOVUS BIOLOGICALS | Cat #: NBP2-59770 | antibody for Opa1 C-terminal detection |
Slidebook | Intelligent imaging | RRID: SCR_014300 | software tool |
Teflon threaded seal tape | Fisher Scientific | NC0636085 | taflon tape for sample storage |
Texas Red 1,2-Dihexadecanoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine, Triethylammonium Salt (Texas Red DHPE) | ThermoFisher Scientific | Cat #: T1395MP | membrane fluorescent markers |