Точное картирование мозга для выполнения повторяющихся In Vivo Изображения нейро-иммунной динамики у мышей

Центральная нервная система (ЦНС) регулируется сложным взаимодействием взаимодействий между различными типами клеток-резидентов, включая нейроны, глию и клетки, связанные с сосудами. Традиционно, нервные клетки были изучены в изолированных, совместно культивируется^1,2,^3,4^,,5 (in vitro) или вырезанной ткани мозга (ex vivo)^6,7,8,9,10 контекстов.⁴ Тем не менее, необходимо дальнейшее понимание поведения нейронных клеток и взаимодействий в родной среде нетронутыми мозга in vivo. В этом протоколе мы описываем метод картирования регионов, представляющих интерес in vivo, и точно переохотвердем эти регионы в будущих сеансах визуализации для отслеживания сложных взаимодействий между различными типами клеток ЦНС в течение длительных периодов времени.

Развитие подходов к визуализации in vivo дало значительные выгоды для правильного понимания нервной функции^{11,,12,,13,,14,,15.} В частности, эти подходы дают ряд преимуществ по сравнению с традиционными подходами in vitro и ex vivo. Во-первых, в vivo системы визуализации имеют физиологически соответствующие компоненты клеток и тканей, такие как сосуды с полным репертуаром клеточных взаимодействий, чтобы обеспечить полное понимание физиологии нейронной сети. Во-вторых, последние результаты показывают, что при удалении из их родной среды, некоторые нервные клетки (например, микроглии) теряют важные особенности их идентичности и, таким образом, физиологии^16,17, которые могут быть сохранены в in vivo настройки. В-третьих, in vivo системы визуализации предоставляют возможность для стабильных продольных исследований от нескольких недель до нескольких месяцев для изучения ЦНС клеточного взаимодействия. Наконец, учитывая растущие данные о вкладах от периферической иммунной системы^18,19 и микробиома^20,21 в физиологии ЦНС, in vivo системы обеспечивают платформу для допроса таких вкладов и воздействия на клетки ЦНС. Таким образом, подходы, которые используют продольные in vivo изображения для изучения нейро-иммунной физиологии и взаимодействия в здоровых, раненых и больных состояний являются большим дополнением к традиционным подходам.

В этом протоколе мы описываем надежный подход к изображению различных типов клеток в головном мозге, включая микроглии, нейроны и клетки NG2^в качестве примеров. Разработаны два подхода к визуализации нервных клеток in vivo: истонченный подход черепа и открытый череп с подходом к черепному окну. Хотя разбавленный череп подходы используются и предпочтительнее, потому что они преодолевают некоторые из недостатков открытого подхода черепа, таких как активация глиальных клеток, выше, чем физиологическая динамика позвоночника и использование противовоспалительных агентов^22,23,^24,,25, разбавленный череп подходы также показывают несколько критических недостатков. Во-первых, процедура истончения является очень деликатной процедурой, которую многие исследователи трудно усовершенствовать, особенно когда необходимо повторное утончение. Это так, потому что часто трудно для экспериментаторов, чтобы убедиться, что они истончили череп до глубины 20 мкм. Во-вторых, для адекватных сравнений между мышами, истончение должно быть идентичным и различные истончение успеха между изображений сессий или мышей может осложнить визуализацию нервных структур. В-третьих, при использовании для продольной визуализации, животные с истонченными черепами могут быть использованы только для ограниченного числа сеансов при повторном разжижении черепа. В-четвертых, так как некоторые из костной ткани все еще остается, ясность в глубине изображения может быть скомпрометирована от истонченного подхода черепа позволяет большой визуализации более поверхностным, но не так много с более глубокими регионами. В свете этого, более глубокие структуры мозга, такие как гиппокамп, не могут быть успешно изображены с истонченным подходом черепа. Эти соображения высовы воспитывают необходимость в альтернативных и взаимодополняющих подходах, которые могли бы преодолеть эти озабоченности.

Альтернатива истонченным подходом черепа, открытый подход к имплантации окна черепа использует процедуру, в которой череп заменяется оптически ясным стеклом. Это позволяет почти неограниченное количество сеансов визуализации. Кроме того, при замене черепа на стекло крышки, этот метод позволяет четкое окно просмотра флуоресцентно помечены клетки мозга в течение длительных периодов от нескольких часов до месяцев и, следовательно, могут быть использованы для изучения активности клеток и взаимодействий, которые имеют отношение к физиологии, старения и патологии.

В целом, мы подробно шаги, которые могут следовать, чтобы сделать имплантат хронических черепных окон через стереотаксисную краниотомию, что позволяет in vivo изображения областей мозга, представляющих интерес. Мы также описываем, как чрезвычайно стабильная сосуды мозга или флуоресцентно помеченные дендриты могут быть использованы для создания грубой или тонкой карты, соответственно, областей мозга, представляющих интерес. Этот подход может быть использован для повторного изображения в течение нескольких сессий. Важность этого метода, таким образом, заключается в его способности образ долгосрочных изменений или застой в элементах мозга, включая расположение, морфология, и взаимодействия различных клеточных типов.