Farelerde Nöro-İmmün Dinamiğin Vivo Görüntülemesinde Tekrarlayan Performans için Hassas Beyin Haritalaması
Summary
Bu protokol, nöro-glio-vasküler yapıların uzunlamasına görüntülemesi, hem sağlıklı hem de hastalıklı koşullarda fonksiyon ve fonksiyon için kullanılabilecek kronik bir kafatası pencere implantasyon tekniğini açıklamaktadır. Genellikle tercih edilirken bazı kritik sınırlamalara sahip olan transkraniyal görüntüleme yaklaşımına tamamlayıcı bir alternatif olarak hizmet vermektedir.
Abstract
Merkezi sinir sistemi (CNS) nöronal karmaşık bir etkileşim tarafından düzenlenir, glial, stromal, ve vasküler hücrelerin uygun işlevini kolaylaştırmak. Her ne kadar bu hücreleri in vitro veya birlikte ex vivo izole olarak incelemek yararlı fizyolojik bilgiler sağlar; nöral hücre fizyolojisinin belirgin özellikleri bu bağlamda özlenecektir. Bu nedenle, in vivo ortamda kendi yerli nöral hücrelerin incelenmesi için bir ihtiyaç vardır. Burada ayrıntılı protokol, kemirgen korteksteki nöral hücrelerin in vivo iki foton görüntülemesini, belirli hücreleri saatler ile aylar arasında uzun süreler boyunca görselleştirmek ve incelemek için bir araç olarak tanımlar. Biz ayrıntılı olarak kaba bir harita veya floresan ilgi belirli beyin bölgelerinin ince bir harita olarak dendritler etiketli olarak brüt kararlı beyin vaskülatür kullanımını açıklar. Bu haritaları görsel bir anahtar olarak kullanarak, nöral hücrelerin in vivo görüntülemede sonraki tekrarlayan lar için nasıl tam olarak yer değiştirilebileceğini gösteriyoruz. Floresan etiketli mikroglia, nöronlar ve NG2+ hücrelerin in vivo görüntüleme örneklerini kullanarak, bu protokol bu tekniğin uzun süre boyunca aynı beyin yerinde hücresel dinamiklerin tekrarlayan görselleştirme izin yeteneğini göstermektedir, bu daha fazla normal fizyoloji veya aşağıdaki patolojik hakaret bu hücrelerin yapısal ve fonksiyonel tepkileri anlamada yardımcı olabilir. Gerektiğinde bu yaklaşım, örneğin kalsiyum görüntüleme ile nöral hücrelerin fonksiyonel görüntüleme ile birleştiğinde olabilir. Bu yaklaşım, özellikle genetik fare modelleri veya ilgi hücreleri etiketlemek için farklı floresan etiketleri ile belirli boyalar mevcut olduğunda cns in vivo farklı hücre türleri arasındaki fiziksel etkileşimi görselleştirmek için güçlü bir tekniktir.
Introduction
Merkezi sinir sistemi (CNS) nöronlar, glia ve damar ilişkili hücreler de dahil olmak üzere çeşitli yerleşik hücre türleri arasındaki etkileşimlerin karmaşık bir etkileşim tarafından yönetilir. Geleneksel olarak, nöral hücreler izole, co-kültürlü1,2,,3,4,5 (in vitro) veya excised beyin dokusu (ex vivo)6,7,8,9,10 bağlamlarda incelenmiştir., Ancak, daha fazla in vivo bozulmamış beynin yerli ortamda nöral hücre davranışı ve etkileşimleri anlamak için ihtiyaç vardır. Bu protokolde, in vivo ilgi alanlarının haritasını çıkarmak ve bu bölgeleri gelecekteki görüntüleme oturumlarında tam olarak yeniden görebilmek için çeşitli CNS hücre türleri arasındaki karmaşık etkileşimleri uzun süreler boyunca izlemek için bir yöntem açıklıyoruz.
In vivo görüntüleme yaklaşımlarının geliştirilmesi nöral fonksiyonun doğru anlaşılması için önemli kazanımlar sağlamıştır11,12,13,,14,15. Özellikle, bu yaklaşımlar geleneksel in vitro ve ex vivo yaklaşımlar üzerinde çeşitli avantajlar sağlar. İlk olarak, in vivo görüntüleme sistemleri nöral ağ fizyolojisi tam bir anlayış sağlamak için hücresel etkileşimlerin tam repertoi ile vaskülatür gibi fizyolojik olarak ilgili hücre ve doku bileşenleri var. İkinci olarak, son bulgular kendi doğal ortamdan kaldırıldığında, bazı nöral hücrelerin (mikroglia gibi) kimliklerinin önemli özelliklerini kaybetmek ve böylece fizyoloji16,17 in vivo ortamda korunabilir öneririz. Üçüncü olarak, in vivo görüntüleme sistemleri CNS hücresel etkileşimleri incelemek için haftalar ile aylar arasında istikrarlı uzunlamasına araştırmalar alametim sağlar. Son olarak, periferik bağışıklık sistemi katkıları için artan kanıt göz önüne alındığında18,19 ve mikrobiyom20,21 CNS fizyolojisi, in vivo sistemleri cns hücreleri üzerinde bu tür katkıları ve etkileri sorgulamak için bir platform sağlar. Bu nedenle, nöro-immün fizyoloji ve sağlıklı, yaralı ve hastalıklı durumlarda etkileşimleri incelemek için in vivo görüntüleme de longitudinal kullanan yaklaşımlar geleneksel yaklaşımlara büyük bir tamamlayıcı ektir.
Bu protokolde, mikroglia, nöronlar ve NG2+ hücreleri de dahil olmak üzere beyindeki farklı hücre tiplerini görüntülemek için güvenilir bir yaklaşımı örnek olarak tanımlıyoruz. In vivo nöral hücreleri görselleştirmek için iki yaklaşım geliştirilmiştir: inceltilmiş kafatası yaklaşımı ve kafatası pencere yaklaşımı ile açık kafatası. İnceltilmiş kafatası yaklaşımları kullanımda olmasına ve glial hücre aktivasyonu, daha yüksek fizyolojik omurga dinamiği ve anti-inflamatuar ajanların kullanımı22,23,,24,25, inceltilmiş kafatası yaklaşımları gibi açık kafatası yaklaşımının bazı dezavantajları aşmak çünkü tercih edilir de birkaç kritik sakıncaları göstermektedir. İlk olarak, incelme prosedürü birçok araştırmacı özellikle yeniden inceltme gerekli olduğunda mükemmel bulmak zor bir çok hassas bir işlemdir. Bu durum, deneycilerin kafatasını ~20 μm derinliğe kadar inceltmiş olduklarını tespit etmeleri genellikle zor olduğundan durum böyledir. İkinci olarak, fareler arasında yeterli karşılaştırmalar için, inceltme aynı olması gerekir ve görüntüleme oturumları veya fareler arasında inceltme başarı çeşitli nöral yapıların görselleştirilmesi karmaşık olabilir. Üçüncü olarak, uzunlamasına görüntüleme için kullanıldığında, inceltilmiş kafatasları olan hayvanlar sadece kafatasının yeniden inceltilmesi kullanıldığında sınırlı sayıda seans için kullanılabilir. İleri, bazı kemik dokusu hala kalır bu yana, görüntüleme derinliği netlik daha yüzeysel ama çok daha derin bölgeler ile büyük görselleştirme için izin inceltilmiş kafatası yaklaşımı tehlikeye olabilir. Bunun ışığında, hipokampus gibi daha derin beyin yapıları, inceltilmiş kafatası yaklaşımı ile başarılı bir şekilde görüntülenemez. Bu hususlar, bu endişelerin üstesinden gelebilecek alternatif ve tamamlayıcı yaklaşımlara duyulan ihtiyacı gündeme getirecektir.
İnceltilmiş kafatası yaklaşımına alternatif olarak, açık kafatası penceresi implantasyon yaklaşımı, kafatasının optik olarak net cam kapak kaydırışla değiştirildiği bir prosedür kullanır. Bu, neredeyse sınırsız sayıda görüntüleme oturumu na olanak sağlar. Ayrıca, cam kapak lı kafatasının değiştirilmesi göz önüne alındığında, bu yöntem floresan etiketli beyin hücrelerinin saatlerce nisbeten aylara kadar geniş süreler için net bir görüntüleme penceresi sağlar ve bu nedenle, fizyoloji, yaşlanma ve patoloji ile ilgili hücre aktivitesi ve etkileşimleri incelemek için istihdam edilebilir.
Genel olarak, ilgi beyin bölgelerinin in vivo görüntüleme sağlayan bir stereotaksik kraniyotomi ile implant kronik kranial pencereler yapmak için takip edilebilir adımları ayrıntılı. Ayrıca, brüt olarak kararlı beyin vaskülatürü veya floresan etiketli dendritlerin, ilgi çekici beyin bölgelerinin sırasıyla kaba veya güzel bir haritasını oluşturmak için nasıl kullanılabileceğini de anlatıyoruz. Bu yaklaşım daha sonra birkaç oturum boyunca tekrarlanan görüntüleme için kullanılabilir. Bu tekniğin önemi, bu nedenle, düzenleme, morfoloji ve farklı hücresel türlerin etkileşimleri de dahil olmak üzere beyin elemanlarında uzun vadeli değişiklikler veya durağan görüntü yeteneği yatıyor.
Protocol
Representative Results
Discussion
In vivo iki foton görüntüleme gelişiyle sağlıklı beyinde meydana gelen hücresel etkileşimler ve dinamikleri bolluk keşfetmek için fırsatlar açtı. İlk çalışmalar hem akut hem de kronik görüntüleme ile görüntü nöronal dendritler için açık kafatası kraniyotomi yaklaşımı kullanarak odaklanmıştır37,38. Bu da beyindeki nöroimmün etkileşimleri açıklamak için kullanılabilir. Bu protokol, kısa veya uzun vadede uzun süre floresan…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Eyo laboratuvarı üyelerine bu el yazmasında sunulan fikirleri tartıştıkları için teşekkür ederiz. Biz NG2DsRed fareler33hediye için Virginia Üniversitesi’nde Kipnis Lab Dr Justin Rustenhoven teşekkür ederiz. Bu çalışma, Ulusal Nörolojik Bozukluklar ve Ulusal Sağlık Enstitüsü İnme Enstitüsü’nden U.B.E’ye (K22 NS104392) yapılan fonla desteklenmiştir.
Materials
| Coverglass (3mm) | Warner Instruments | 64-0726 | |
| Cyanoacrylate glue (Krazy Glue) | Amazon | https://www.amazon.com/Krazy-Glue-Original-Purpose-Instant/dp/B07GSF31WZ/ref=sr_1_2?keywords=krazy+glue&qid=1583856837&s=pet-supplies&sr=8-2 | |
| Demi Ultra LED Curing Light System | Dental Health Products, Inc | 910860-1 | |
| Dental Drill | Osada: www.osadausa.edu | EXL-M40 | |
| Drill Bit | Fine Science Tools | #19008-07 | |
| Eye Ointment | Henry Schien | 1338333 | |
| iBond Total Etch (Primer glue) | Chase Dental Supply (Heraeus Kulzer) | 66040094 | |
| Rhodamine B | Millipore Sigma | 81-88-9 (R6626) | |
| Tetris Evoflow glue (Final glue) | Top Dent (Ivoclar Vivadent) | #595956 | |
| Wahl Brav Mini+ | Amazon | https://www.amazon.com/Wahl-Professional-Animal-BravMini-41590-0438/dp/B00IN24ILE/ref=asc_df_B00IN24ILE/?tag=hyprod-20&linkCode=df0&hvadid=167141013968&hvpos=&hvnetw=g&hvrand=12368793083893626704&hvpone=&hvptwo=&hvqmt=&hvdev=c&hvdvcmdl=&hvlocint=&hvlocphy=9008337&hvtargid=pla-332197544154&psc=1 |
References
- Engle, S. J., Blaha, L., Kleiman, R. J. Best Practices for Translational Disease Modeling Using Human iPSC-Derived Neurons. Neuron. 100 (4), 783-797 (2018).
- Osaki, T., Shin, Y., Sivathanu, V., Campisi, M., Kamm, R. D. In Vitro Microfluidic Models for Neurodegenerative Disorders. Advanced Healthcare Materials. 7 (2), (2018).
- Croushore, C. A., Sweedler, J. V. Microfluidic systems for studying neurotransmitters and neurotransmission. Lab Chip. 13 (9), 1666-1676 (2013).
- Wu, V. W., Schwartz, J. P. Cell culture models for reactive gliosis: new perspectives. J Neuroscience Research. 51 (6), 675-681 (1998).
- Abbott, N. J. Astrocyte-endothelial interactions and blood-brain barrier permeability. Journal of Anatomy. 200 (6), 629-638 (2002).
- Humpel, C. Organotypic brain slice cultures: A review. Neuroscience. 305, 86-98 (2015).
- Pena, F. Organotypic cultures as tool to test long-term effects of chemicals on the nervous system. Current Medicinal Chemistry. 17 (10), 987-1001 (2010).
- Humpel, C. Organotypic Brain Slice Cultures. Current Protocols in Immunology. 123 (1), 59 (2018).
- Heine, C., Franke, H. Organotypic slice co-culture systems to study axon regeneration in the dopaminergic system ex vivo. Methods in Molecular Biology. 1162, 97-111 (2014).
- Croft, C. L., Futch, H. S., Moore, B. D., Golde, T. E. Organotypic brain slice cultures to model neurodegenerative proteinopathies. Molecualar Neurodegeneration. 14 (1), 45 (2019).
- Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
- Kerr, J. N., Denk, W. Imaging in vivo: watching the brain in action. Nature Review Neurosciences. 9 (3), 195-205 (2008).
- Akassoglou, K., et al. In Vivo Imaging of CNS Injury and Disease. Journal of Neuroscience. 37 (45), 10808-10816 (2017).
- Tran, C. H., Gordon, G. R. Astrocyte and microvascular imaging in awake animals using two-photon microscopy. Microcirculation. 22 (3), 219-227 (2015).
- Tvrdik, P., Kalani, M. Y. S. In Vivo Imaging of Microglial Calcium Signaling in Brain Inflammation and Injury. International Journal of Molecular Sciences. 18 (11), 2366 (2017).
- Bennett, F. C., et al. A Combination of Ontogeny and CNS Environment Establishes Microglial Identity. Neuron. 98 (6), 1170-1183 (2018).
- Bohlen, C. J., et al. Diverse Requirements for Microglial Survival, Specification, and Function Revealed by Defined-Medium Cultures. Neuron. 94 (4), 759-773 (2017).
- Mueller, K. L., Hines, P. J., Travis, J. Neuroimmunology. Science. 353 (6301), 760-761 (2016).
- Kipnis, J., Filiano, A. J. Neuroimmunology in 2017: The central nervous system: privileged by immune connections. Nature Reviews Immunology. 18 (2), 83-84 (2018).
- Moloney, R. D., Desbonnet, L., Clarke, G., Dinan, T. G., Cryan, J. F. The microbiome: stress, health and disease. Mammalian Genome. 25 (1-2), 49-74 (2014).
- Skonieczna-Zydecka, K., Marlicz, W., Misera, A., Koulaouzidis, A., Loniewski, I. Microbiome-The Missing Link in the Gut-Brain Axis: Focus on Its Role in Gastrointestinal and Mental Health. Journal of Clinical Medicine. 7 (12), 521 (2018).
- Xu, H. T., Pan, F., Yang, G., Gan, W. B. Choice of cranial window type for in vivo imaging affects dendritic spine turnover in the cortex. Nature Neuroscience. 10 (5), 549-551 (2007).
- Pan, F., Gan, W. B. Two-photon imaging of dendritic spine development in the mouse cortex. Developmental Neurobiology. 68 (6), 771-778 (2008).
- Yang, G., Pan, F., Parkhurst, C. N., Grutzendler, J., Gan, W. B. Thinned-skull cranial window technique for long-term imaging of the cortex in live mice. Nature Protocols. 5 (2), 201-208 (2010).
- Grutzendler, J., Yang, G., Pan, F., Parkhurst, C. N., Gan, W. B. Transcranial two-photon imaging of the living mouse brain. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (9), (2011).
- Jung, S., et al. Analysis of fractalkine receptor CX(3)CR1 function by targeted deletion and green fluorescent protein reporter gene insertion. Molecular Cell Biology. 20 (11), 4106-4114 (2000).
- Liu, Y. U., et al. Neuronal network activity controls microglial process surveillance in awake mice via norepinephrine signaling. Nature Neuroscience. 22 (11), 1771-1781 (2019).
- Stowell, R. D., et al. Noradrenergic signaling in the wakeful state inhibits microglial surveillance and synaptic plasticity in the mouse visual cortex. Nature Neuroscience. 22 (11), 1782-1792 (2019).
- Sun, W., et al. In vivo Two-Photon Imaging of Anesthesia-Specific Alterations in Microglial Surveillance and Photodamage-Directed Motility in Mouse Cortex. Frontiers in Neuroscience. 13, 421 (2019).
- Juczewski, K., Koussa, J., Kesner, A., Lee, J., Lovinger, D. Stress and behavioral correlates in the head-fixed method. bioRxiv. , (2020).
- Feng, G., et al. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28 (1), 41-51 (2000).
- Eyo, U. B., et al. P2Y12R-Dependent Translocation Mechanisms Gate the Changing Microglial Landscape. Cell Reports. 23 (4), 959-966 (2018).
- Nishiyama, A., Komitova, M., Suzuki, R., Zhu, X. Polydendrocytes (NG2 cells): multifunctional cells with lineage plasticity. Nature Review Neurosciences. 10 (1), 9-22 (2009).
- Zhu, X., Bergles, D. E., Nishiyama, A. NG2 cells generate both oligodendrocytes and gray matter astrocytes. Development. 135 (1), 145-157 (2008).
- Hughes, E. G., Kang, S. H., Fukaya, M., Bergles, D. E. Oligodendrocyte progenitors balance growth with self-repulsion to achieve homeostasis in the adult brain. Nature Neuroscience. 16 (6), 668-676 (2013).
- Berthiaume, A. A., et al. Dynamic Remodeling of Pericytes In Vivo Maintains Capillary Coverage in the Adult Mouse Brain. Cell Reports. 22 (1), 8-16 (2018).
- Trachtenberg, J. T., et al. Long-term in vivo imaging of experience-dependent synaptic plasticity in adult cortex. Nature. 420 (6917), 788-794 (2002).
- Holtmaat, A. J., et al. Transient and persistent dendritic spines in the neocortex in vivo. Neuron. 45 (2), 279-291 (2005).
- Wang, C., Mei, L. In utero electroporation in mice. Methods in Molecular Biology. 1018, 151-163 (2013).
- Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. Mouse in utero electroporation: controlled spatiotemporal gene transfection. Journal of Visualized Experiments. (54), e3024 (2011).
- Chakrabarty, P., et al. Capsid serotype and timing of injection determines AAV transduction in the neonatal mice brain. PLoS One. 8 (6), 67680 (2013).
- Guenthner, C. J., Miyamichi, K., Yang, H. H., Heller, H. C., Luo, L. Permanent genetic access to transiently active neurons via TRAP: targeted recombination in active populations. Neuron. 78 (5), 773-784 (2013).
- Pilz, G. A., et al. Live imaging of neurogenesis in the adult mouse hippocampus. Science. 359 (6376), 658-662 (2018).
- Wu, J., et al. Kilohertz two-photon fluorescence microscopy imaging of neural activity in vivo. Nature Methods. 17 (3), 287-290 (2020).
- Yang, W., Yuste, R. In vivo imaging of neural activity. Nature Methods. 14 (4), 349-359 (2017).
- Hannan, S., et al. In vivo imaging of deep neural activity from the cortical surface during hippocampal epileptiform events in the rat brain using electrical impedance tomography. Neuroimage. 209, 116525 (2020).
- Kulkarni, R. U., et al. In Vivo Two-Photon Voltage Imaging with Sulfonated Rhodamine Dyes. ACS Central Science. 4 (10), 1371-1378 (2018).
- Chamberland, S., et al. Fast two-photon imaging of subcellular voltage dynamics in neuronal tissue with genetically encoded indicators. Elife. 6, (2017).
