Nauwkeurige brain mapping om repetitieve in vivo beeldvorming van neuro-immuundynamica in muizen uit te voeren

Het centrale zenuwstelsel (CNS) wordt beheerst door een complex samenspel van interacties tussen verschillende ingezeten celtypen, waaronder neuronen, glia en aan bloedvaten geassocieerde cellen. Traditioneel werden neurale cellen bestudeerd in geïsoleerde, co-gekweekte^1,,2,,3,4,5 (in vitro) of uitgesneden hersenweefsel (ex vivo)^6,7,8,9,10 contexten. Echter, er is behoefte aan verder te begrijpen neurale cel gedrag en interacties in de inheemse omgeving van de intacte hersenen in vivo. In dit protocol beschrijven we een methode om in vivo regio’s van belang in kaart te brengen en deze regio’s nauwkeurig opnieuw te beelden in toekomstige beeldvormingssessies om de complexe interacties tussen de verschillende CNS-celtypen gedurende langere perioden bij te houden.

De ontwikkeling van in vivo beeldvormingsbenaderingen heeft aanzienlijke voordelen opgeleverd voor het juiste begrip van neurale functie^{11,12,13,14,15}. Met name deze benaderingen bieden verschillende voordelen ten opzichte van traditionele in vitro en ex vivo benaderingen. Ten eerste hebben in vivo beeldvormingssystemen fysiologisch relevante cel- en weefselcomponenten zoals de vasculatuur met het volledige repertoire van cellulaire interacties om een volledig begrip van neurale netwerkfysiologie te bieden. Ten tweede, recente bevindingen suggereren dat wanneer verwijderd uit hun eigen omgeving, bepaalde neurale cellen (zoals microglia) belangrijke kenmerken van hun identiteit en dus fysiologie^16,17 die kunnen worden bewaard in de in vivo instelling te verliezen. Ten derde bieden in vivo beeldvormingssystemen de mogelijkheid voor stabiele longitudinale onderzoeken van weken tot maanden om cellulaire interacties van CNS te bestuderen. Ten slotte bieden in vivo-systemen, gezien het groeiende bewijs voor bijdragen van het perifere immuunsysteem^18,,19 en het microbioom^20,21 in de CNS-fysiologie, een platform om dergelijke bijdragen en effecten op CNS-cellen te ondervragen. Dus, benaderingen die longitudinale in vivo beeldvorming gebruiken om neuro-immuun fysiologie en interacties in gezonde, gewonde en zieke toestanden te bestuderen zijn een grote aanvulling op traditionele benaderingen.

In dit protocol beschrijven we een betrouwbare benadering van verschillende celtypen in de hersenen, waaronder microglia, neuronen en NG2⁺ cellen als voorbeelden. Er zijn twee benaderingen ontwikkeld om neurale cellen in vivo te visualiseren: de uitgedunde schedelbenadering en de open schedel met een craniale raambenadering. Hoewel uitgedunde schedelbenaderingen in gebruik zijn en de voorkeur hebben omdat ze enkele van de nadelen van de open schedelbenadering overwinnen, zoals gliacelactivering, hoger dan fysiologische wervelkolomdynamiek en het gebruik van ontstekingsremmende middelen^22,23,24,25, uitgedunde schedelbenaderingen vertonen ook een paar kritische nadelen. Ten eerste is de dunner wordende procedure een zeer delicate procedure die veel onderzoekers moeilijk vinden om te perfectioneren, vooral wanneer het opnieuw uitdunnen noodzakelijk is. Dit is het geval omdat het vaak moeilijk is voor onderzoekers om na te gaan dat ze de schedel hebben uitgedund tot een ~ 20 μm diepte. Ten tweede, voor adequate vergelijkingen tussen muizen, dunner zou moeten identiek zijn en een verscheidenheid van dunner wordend succes tussen beeldvorming sessies of muizen kunnen compliceren visualisatie van neurale structuren. Ten derde, wanneer ze worden gebruikt voor longitudinale beeldvorming, kunnen dieren met uitgedunde schedels slechts voor een beperkt aantal sessies worden gebruikt wanneer het opnieuw uitdunnen van de schedel wordt gebruikt. Forth, aangezien sommige van het botweefsel nog steeds overblijft, duidelijkheid in de diepte van de beeldvorming kan worden aangetast van de uitgedunde schedel benadering waardoor grote visualisatie van meer oppervlakkige, maar niet zo veel met diepere regio’s. In het licht hiervan kunnen diepere hersenstructuren zoals de hippocampus niet succesvol worden afgebeeld met de uitgedunde schedelbenadering. Deze overwegingen doen de noodzaak van alternatieve en complementaire benaderingen aan de orde die deze zorgen kunnen wegnemen.

Als alternatief voor de uitgedunde schedelbenadering, maakt de open schedelvensterimplantatiebenadering gebruik van een procedure waarbij de schedel wordt vervangen door een optisch heldere glazen coverslip. Dit zorgt voor een vrijwel onbeperkt aantal beeldvormingssessies. Bovendien, gezien de vervanging van de schedel door de glazen coverslip, deze methode zorgt voor een duidelijk kijkvenster van fluorescerend getagde hersencellen voor uitgebreide perioden van uren tot maanden en, daarom, kan worden gebruikt om celactiviteit en interacties die relevant zijn voor fysiologie, veroudering en pathologie te bestuderen.

Over het algemeen beschrijven we stappen die kunnen worden gevolgd om chronische craniale vensters te implanteren door middel van een stereotaxic craniotomie die in vivo beeldvorming van hersengebieden van belang mogelijk maakt. We beschrijven ook hoe de schromelijk stabiele hersenen vasculatuur of de fluorescerende gelabelde dendrieten kunnen worden gebruikt om een grove of een fijne kaart te genereren, respectievelijk van de hersenen regio’s van belang. Deze aanpak kan vervolgens worden gebruikt voor herhaalde beeldvorming gedurende meerdere sessies. Het belang van deze techniek ligt daarom in zijn vermogen om de langetermijnveranderingen of stasis in hersenelementen in beeld te brengen, waaronder de opstelling, morfologie en interacties van de verschillende cellulaire typen.