Mapeamento cerebral preciso para realizar imagens repetitivas in vivo da dinâmica neuro-imune em camundongos

O sistema nervoso central (SNC) é regido por uma complexa interação entre vários tipos de células residentes, incluindo neurônios, glia e células associadas a vasos. Tradicionalmente, as células neurais eram estudadas em tecidos cerebrais isolados, co-cultivados^1,,2,,3,,4,5 (in vitro) ou tecido cerebral exsequipado (ex vivo)^{6,,7,,8,,9,,10} contextos. No entanto, é necessário entender melhor o comportamento das células neurais e as interações no ambiente nativo do cérebro intacto in vivo. Neste protocolo, descrevemos um método para mapear regiões in vivo de interesse e reimagem precisamente essas regiões em futuras sessões de imagem para acompanhar as interações complexas entre os vários tipos de células CNS ao longo de longos períodos de tempo.

O desenvolvimento de abordagens de imagem in vivo proporcionou ganhos significativos para a compreensão adequada da função neural^{11,,12,,13,14,,15}. Especificamente, essas abordagens oferecem várias vantagens em relação às abordagens in vitro e ex vivo tradicionais. Primeiro, os sistemas de imagem in vivo possuem componentes fisiologicamente relevantes de células e tecidos, como a vasculatura com o repertório completo das interações celulares para proporcionar uma compreensão completa da fisiologia da rede neural. Em segundo lugar, achados recentes sugerem que, quando removidas de seu ambiente nativo, certas células neurais (como a microglia) perdem características importantes de sua identidade e,^portanto,fisiologia¹⁶,¹⁷ que podem ser preservadas no cenário in vivo. Em terceiro lugar, os sistemas de imagem in vivo oferecem a oportunidade de investigações longitudinais estáveis de semanas a meses para estudar as interações celulares do CNS. Finalmente, dadas as evidências crescentes de contribuições do sistema imunológico periférico^18,19 e do microbioma^20,21 na fisiologia do CNS, os sistemas in vivo fornecem uma plataforma para interrogar tais contribuições e efeitos sobre as células CNS. Assim, abordagens que empregam imagens longitudinais in vivo para estudar fisiologia neuroi imune e interações em estados saudáveis, feridos e doentes são uma grande adição complementar às abordagens tradicionais.

Neste protocolo, descrevemos uma abordagem confiável para a imagem de diferentes tipos de células no cérebro, incluindo microglia, neurônios e células NG2⁺ como exemplos. Duas abordagens para visualizar células neurais in vivo foram desenvolvidas: a aproximação do crânio diluído e o crânio aberto com uma aproximação da janela craniana. Embora abordagens finas do crânio estejam em uso e sejam preferidas porque superam algumas das desvantagens da abordagem do crânio aberto, como ativação celular gliana, dinâmica da coluna vertebral mais alta que fisiológica e o uso de agentes anti-inflamatórios^{22,,23,,24,,25}, abordagens finas do crânio também mostram algumas desvantagens críticas. Em primeiro lugar, o procedimento de afinamento é um procedimento muito delicado que muitos pesquisadores acham difícil de aperfeiçoar especialmente quando o diluir é necessário. Este é o caso porque muitas vezes é difícil para os experimentadores verificar que eles diminuíram o crânio a uma profundidade de ~20 μm. Em segundo lugar, para comparações adequadas entre camundongos, o afinamento precisaria ser idêntico e uma variedade de sucesso de afinamento entre sessões de imagem ou camundongos poderia complicar a visualização de estruturas neurais. Em terceiro lugar, quando empregados para imagens longitudinais, animais com crânios finos só podem ser usados para um número limitado de sessões quando o diluir do crânio é empregado. Por diante, uma vez que parte do tecido ósseo ainda permanece, a clareza em profundidade da imagem pode ser comprometida a partir da abordagem do crânio diluído permitindo uma grande visualização de regiões mais superficiais, mas não tanto com regiões mais profundas. À luz disso, estruturas cerebrais mais profundas, como o hipocampo, não podem ser imagens com sucesso com a aproximação do crânio diluído. Essas considerações levantam a necessidade de abordagens alternativas e complementares que possam superar essas preocupações.

Alternativa à abordagem do crânio diluído, a abordagem de implantação da janela aberta do crânio usa um procedimento no qual o crânio é substituído por uma mancha de vidro opticamente clara. Isso permite um número quase ilimitado de sessões de imagem. Além disso, dada a substituição do crânio pelo deslizamento de tampa de vidro, este método permite uma janela de visualização clara de células cerebrais fluorescentes marcadas por longos períodos de horas a meses e, portanto, pode ser empregado para estudar a atividade celular e interações relevantes para fisiologia, envelhecimento e patologia.

No geral, detalhamos etapas que podem ser seguidas para fazer o implante de janelas cranianas crônicas através de uma craniotomia estereotaxa que permite imagens in vivo de regiões cerebrais de interesse. Também descrevemos como a vasculatura cerebral grosseiramente estável ou os dendritos fluorescentes rotulados poderiam ser usados para gerar um mapa grosseiro ou fino, respectivamente, das regiões cerebrais de interesse. Esta abordagem pode então ser usada para imagens repetidas ao longo de várias sessões. A importância dessa técnica, portanto, reside em sua capacidade de imaginar as mudanças ou estase a longo prazo em elementos cerebrais, incluindo o arranjo, morfologia e interações dos diferentes tipos celulares.